15個基因座復合擴增體系的建立及新疆維吾爾族遺傳多態(tài)性

桂 娟 ，劉海渤 ，廖琴香 ，徐 旭 ，魯 滌 ，袁 麗

（1.司法文明協同創(chuàng)新中心，北京 100088；2.中國政法大學 證據科學教育部重點實驗室，北京 100088；3.兵團公安局物證鑒定中心，新疆 烏魯木齊 830000）

短串聯重復序列（STR）是以2～6 bp核心序列為重復單位的基因片段結構，其長度一般在100～500bp，具有多態(tài)性好、易于擴增、易自動化檢測、快捷等優(yōu)點，在群體遺傳學研究、疾病相關性研究、法醫(yī)學個體識別和親權鑒定中具有重要的應用價值[1-2]。本研究應用多重聚合酶鏈式反應（PCR）和五色熒光自動化檢測技術建立15個基因座熒光復合擴增體系，并對新疆維吾爾族群體進行遺傳多態(tài)性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

采集新疆維吾爾族無關健康個體血樣299份（均經知情同意）。種屬特異性研究選取猩猩、蜘蛛猴、黑猩猩、黑白獼猴、大猩猩、黑冠獼猴、雪貂等DNA（由公安部物證鑒定中心提供），以及兔、羊、豬、犬、貓、鴨、雞、牛、鯽魚等常見動物肌肉樣本。同一性研究采集志愿者的血液、口腔拭子、帶毛囊的毛發(fā)樣本。系統靈敏度研究采用9947A樣本。

1.1.2 儀器和試劑

9700型PCR擴增儀（美國AB公司），3130遺傳分析儀（美國AB公司），-86℃超低溫冰箱（美國Thermo公司），超純水儀（美國Millpore公司）。

PCR反應緩沖液、ILS500內標（公安部物證鑒定中心），去離子甲酰胺、POP-4膠（美國AB公司），Chelex-100（美國 Bio-RAD 公司），0.5 ng/μL 9947A（美國Promega公司），引物委托上海生工生物有限公司合成，等位基因測序由北京諾賽生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 基因座的篩選

經文獻篩選及前期遺傳學調查，確定13個常染色體 STR 基因座（D4S2366、D9S925、D3S1744、D11S2368、D15S659、D17S1290、D7S3048、GATA198B05、D14S608、D20S470、D18S535、D19S253、D10S1435）、1 個 X 染色體基因座DXS7132和1個性別基因座Amelogenin。

1.2.2 復合擴增體系的建立

根據STR基因座等位基因數目和核心區(qū)域大小安排基因座位置，利用Primer 3軟件重新設計引物，并用 BLAST檢測，分別采用6-FAM、HEX、TAMRA、ROX熒光素標記引物前導鏈5′端，內標使用ILS500，構建五色熒光復合擴增體系。觀察復合體系擴增情況，如出現擴增效率不高、非特異性峰、基因座之間距離在10bp以下者，重新設計基因座引物。

1.2.3 直接擴增法檢測及引物優(yōu)化

在離心管中配置10 μL直接PCR擴增體系，包含：2×MasterMix緩沖液（內含 Taq 酶） 5μL，引物 1～5μL，用去離子水補足至10μL。用打孔直徑0.5mm或1.0mm的打孔器打孔，將樣本FTA血卡分別加入離心管，每次電泳設置9947A陽性對照。

PCR 熱循環(huán)參數：72℃ 20min，95℃ 11min；94℃30s，59℃ 2min，72℃ 1min，27 個循環(huán)；60℃ 60min，25℃保存。在9700型擴增儀上進行PCR擴增。

優(yōu)化各基因座引物濃度，最終實現復合擴增體系中全部基因座的同步擴增和各基因座之間的等位基因峰值基本平衡。

1.2.4 復合擴增體系的可行性研究

同一性及穩(wěn)定性檢測：采集志愿者的血液、口腔拭子、帶毛囊的毛發(fā)。配置PCR反應體系，室溫（15～18℃）分別放置 0、12、24、48、72h 進行 PCR 反應。

系統靈敏度檢測：在10μL擴增體系中分別加入0.8、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.08 ng 的 9947A，測試體系的靈敏度。

種屬特異性檢測：對靈長類動物及常見動物的樣本進行種屬特異性分析，樣本DNA量為0.4～0.8ng。

1.2.5 等位基因測序及命名

對基因座的等位基因測序，按照重復序列重復次數進行命名[3]。

1.2.6 群體遺傳學調查

利用PowerStats v12軟件（美國Promega公司）進行統計學分析，得到13個常染色體STR基因座在新疆維吾爾族群體中的等位基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）、觀察雜合度（Ho）、個體識別率（DP）、非父排除率（PE）。利用Genepop v4.2軟件對基因座的基因型頻率分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗、期望雜合度（He）、連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）檢驗[4]；對 D9S925、D11S2368、D15S659、D17S1290、D7S3048、GATA198B05、D14S608和D20S470等8個基因座在新疆維吾爾族人群與西藏藏族[5]、岫巖滿族[6]和廣州漢族[7]之間比對，進行不同群體間的差異性檢驗。

2 結 果

2.1 直接擴增檢測結果

在10μL直接擴增的PCR反應體系中，各基因座引物濃度優(yōu)化結果為：2.5μmol/L各基因座引物在0.08～0.36μL。15個基因座均得到有效擴增，擴增片段長度在100～330bp，各基因座的等位基因峰均衡性好，且無明顯非特異性峰（圖1）。

圖1 一個樣本的15個基因座復合擴增體系分型圖譜

2.2 復合擴增體系的可行性檢測結果

同一志愿者的血液、口腔拭子、帶毛囊的毛發(fā)各類型樣品得到完整一致的分型；配制好的PCR反應體系室溫（15～18℃）放置72h以內無差異；本體系靈敏度為0.3 ng；在種屬特異性檢驗中，靈長類動物猩猩、大猩猩、黑猩猩可檢出部分等位基因，而蜘蛛猴、黑白獼猴、黑冠獼猴、雪貂、兔、羊、豬、犬、貓、鴨、雞、牛、鯽魚均未檢出特異性峰。

2.3 STR基因座等位基因測序結果

根據基因座等位基因的測序結果，按照標準命名法進行命名，各基因座的核心序列及遺傳定位見表1。

在299名中國維吾爾族無關個體中，D4S2366、D9S925、D3S1744、D11S2368、D15S659、D17S1290、D7S3048、GATA198B05、D14S608、D20S470、D18S535、D19S253、D10S1435和DXS7132基因座在新疆維吾爾族人群中分別檢出等位基因 7、11、9、11、11、13、13、13、11、14、8、9、9 和 8 個，利用 PowerStats v12 軟件計算出14個STR基因座等位基因頻率，結果見表2。

表1 新疆維吾爾族14個STR基因座遺傳特征

表2 新疆維吾爾族14個STR基因座的等位基因頻率 （n=299）

續(xù)表2

2.4 群體遺傳學調查結果

2.4.1 群體遺傳學參數

13個常染色體STR基因座基因型分布經統計學檢驗，所有基因座均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），PIC 在 0.6970～0.863 5，Ho 在 0.745 8～0.872 9，He在 0.741 1～0.877 7，DP 在 0.888 9～0.969 6，PE在0.502 6～0.740 5，結果見表3。13個STR基因座的累積非父排除率和累積個體識別率分別為0.999998和0.999999999999。

表3 新疆維吾爾族13個常染色體STR基因座的群體遺傳學參數 （n=299）

2.4.2 連鎖不平衡檢驗

經LD檢驗，13個常染色體STR基因座不存在連鎖不平衡現象（P＞0.05）。

2.4.3 新疆維吾爾族與其他民族之間的比較

通過群體差異性檢驗，新疆維吾爾族8個基因座等位基因頻率與西藏藏族、岫巖滿族、廣州漢族分別在6、7、8個基因座上差異具有統計學意義（P＜0.05，表 4）。

表4 新疆維吾爾族群體與其他民族比較結果（P值）

3 討 論

目前，在個體識別和親子鑒定案件中主要檢測常染色體STR基因座，大多案件檢測20個以內的STR基因座即可滿足鑒定要求，但是一些疑難復雜的鑒定，如單親、祖孫、同胞、叔侄等案件，往往需要檢測更多的STR基因座。本研究建立的復合擴增體系包括15個基因座，常染色體STR基因座和DXS7132基因座均為四核苷酸重復序列。等位基因命名根據ISFH[3]在1997年提出的從5′方向閱讀，以5′端第1個可能包含在重復序列中的核苷酸為準來命名STR基因座，并結合首先公開發(fā)表的優(yōu)先命名原則。

本研究群體調查采用DNA直接擴增法（以下簡稱“直擴法”），將未經DNA提取或其他前處理步驟的樣本直接加入到PCR反應體系中，以獲得擴增產物。直擴法減少了檢驗步驟，降低了檢驗成本，提高了檢驗效率，在大量樣本的檢測中，特別是在數據庫的建設中能發(fā)揮重要作用。本研究也驗證了利用直擴法能得到比較平衡、穩(wěn)定的圖譜。

新疆維吾爾自治區(qū)地處中國西北，深居亞洲內陸，維吾爾族以信仰伊斯蘭教為主，有自己的語言文字，較少同其他民族通婚，可能積累著本民族的祖系基因。本研究通過對新疆維吾爾族人群進行觀察，發(fā)現13個常染色體STR基因座均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），PIC、He、PE、DP 分別在 0.697 0、0.741 1、0.5026和0.8889以上，屬于高識別率基因座[8]，且影子峰低，利于分型。聯合13個STR基因座的累積非父排除率達0.999998，累積個體識別率達0.999999999999。新疆維吾爾族與西藏藏族、岫巖滿族、廣州漢族在D9S925、D11S2368、D15S659、D17S1290、D7S3048、GATA198B05、D14S608、D20S470 基因座上進行群體比較，差異具有統計學意義。