我國HCV主要基因型優(yōu)勢抗原表位的篩選

萬祥輝　楊細(xì)媚　鄒學(xué)森

檢驗(yàn)與臨床

我國HCV主要基因型優(yōu)勢抗原表位的篩選

萬祥輝楊細(xì)媚鄒學(xué)森

作者單位:330029南昌市，江西省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科（萬祥輝鄒學(xué)森）330030南昌市，江西省兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科（楊細(xì)媚）

目的針對(duì)我國丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）主要基因型篩選出能有效誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫的抗原多肽。方法利用生物信息學(xué)方法預(yù)測評(píng)估我國HCV主要基因型1b、2a、6a型的優(yōu)勢B、CTL和Th抗原表位。以HCV-CTL、HCV-B+HCV-Th、HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th組合肽作為免疫原免疫BALB/C小鼠，經(jīng)乳酸脫氫酶釋放法檢測CTL殺傷活性、ELISPOT法檢測分泌IFN-γ能力、ELISA法檢測抗體滴度，對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果SP2/0對(duì)照細(xì)胞未產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，而SP2/0-NS3實(shí)驗(yàn)細(xì)胞HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th和HCV-CTL均誘導(dǎo)了特異性的CTL應(yīng)答，且當(dāng)效靶比為25∶1和50∶1時(shí)，三組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=2045，F(xiàn)=6338，P均＜0.05），且HCVCTL+HCV-B+HCV-Th聯(lián)合免疫激活的CTL活性高于HCV-CTL單獨(dú)免疫，HCV-CTL單獨(dú)免疫高于PBS空白對(duì)照，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。細(xì)胞體液聯(lián)合免疫、單獨(dú)體液免疫、單獨(dú)細(xì)胞免疫刺激的分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5308，P＜0.05）。單獨(dú)體液免疫、單獨(dú)細(xì)胞免疫刺激的分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量均低于細(xì)胞、體液聯(lián)合免疫，單獨(dú)體液免疫刺激的分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量高于單獨(dú)細(xì)胞免疫，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。不同時(shí)間點(diǎn)不同免疫原所誘導(dǎo)的特異性的IgG抗體滴度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P均＜0.01）。不同時(shí)間點(diǎn)用HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th聯(lián)合免疫和HCV-B+HCV-Th免疫所誘導(dǎo)的特異性IgG抗體滴度均顯著高于PBS空白對(duì)照，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），而細(xì)胞體液聯(lián)合免疫與單獨(dú)體液免疫之間特異性IgG抗體滴度經(jīng)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th聯(lián)合免疫誘導(dǎo)了高效的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，有望進(jìn)一步開發(fā)為有效的重組HCV疫苗。

丙型肝炎病毒；多價(jià)疫苗；基因型；聯(lián)合免疫

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）為單正鏈RNA病毒，是慢性肝病的主要病原體，全球約有1.7億HCV感染患者，我國HCV感染率為3.2%，感染者約3800萬［1］。目前對(duì)于慢性HCV感染，主要治療手段是長效干擾素聯(lián)合利巴韋林的抗病毒治療，有效率僅約為50%。因此，研制安全有效的預(yù)防性及治療性HCV疫苗意義重大。至今仍未研制成功安全有效的HCV疫苗，一個(gè)重要原因是HCV具有高度變異性?；蛐脱芯浚?］顯示，HCV基因型分布具有區(qū)域性特點(diǎn)，我國除西南和港澳地區(qū)以6a型較多外，其他地區(qū)以1b、2a型為主。HCV基因同源性分析［3］顯示，不同基因型間基因組核苷酸差異大于30%，不同亞型間差異大于20%，但同一亞型間不同分離株是相對(duì)保守的，氨基酸同源性大于80%，這使設(shè)計(jì)針對(duì)不同基因型HCV的多重表位成為可能。參與細(xì)胞免疫的主要有CD4+Th和CD8+CTL細(xì)胞，其中CTL可以直接殺傷病毒感染的細(xì)胞，Th細(xì)胞在CTL的激活以及維持中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)激活這兩種細(xì)胞是理想的疫苗設(shè)計(jì)策略［4］。除了細(xì)胞免疫之外，體液免疫對(duì)HCV感染也具有一定的預(yù)防作用［5］。為此本文研究針對(duì)我國HCV主要基因型分別預(yù)測CTL、B和Th表位抗原，利用生物信息學(xué)設(shè)計(jì)篩選出能有效誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的多重HCV表位抗原，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表位抗原的免疫應(yīng)答效果，為HCV疫苗研制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG二抗為Caltag Laboratories Inc.公司產(chǎn)品，LDH細(xì)胞毒性檢測試劑盒為BioVision公司產(chǎn)品，ELISPOT試劑盒為 ImmunoWay公司產(chǎn)品。鋁鹽佐劑alhydrogel為丹麥產(chǎn)品，96孔PVDF濾膜板為Millipore產(chǎn)品。6周齡BALB/c小鼠購自南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SP2/0細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)HCV-NS3蛋白的SP2/0-NS3細(xì)胞由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院何明教授饋贈(zèng)。

1.2表位設(shè)計(jì)、合成以1b型的中國河北株（ABU97067），2a型的美國株 （AAF01178），6a型的中國香港株（ABE98157）為分析對(duì)象，采用單參數(shù)方案（Kyte-Doolittle［6］親水性、Karplus-Schulz［7］柔韌性、Emini［8］表面可及性和Jameson-Wolf［9］抗原指數(shù)）分別預(yù)測我國HCV主要基因型的抗原表位。綜合單參數(shù)預(yù)測結(jié)果后經(jīng)PORTER［10］（http://distill.ucd.ie/ porter/）二級(jí)結(jié)構(gòu)篩選，結(jié)合表位抗原指數(shù)得分（AI）和保守性分析［11］，最終確定優(yōu)勢B細(xì)胞表位。用BIMAS［12］、SYFPEITHI［13］預(yù)測含HLA-A＊0201的CTL限制性表位及含HLA-DRB1＊0301的Th限制性表位。選擇1b、2a、6a基因型最佳的B、CTL、Th細(xì)胞表位，串聯(lián)成HCV-CTL、HCV-Th、HCV-B，委托上海強(qiáng)耀多肽生物公司合成，其純度均大于95%。

1.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)共分四組，每組12只小鼠，以20% alhydrogel為佐劑，分別用 200 μl HCV-CTL（50 μg）、HCV-B+HCV-Th（50 μg）、HCV-CTL+HCV-B+ HCV-Th（50 μg）和PBS皮下多點(diǎn)免疫小鼠，3 w免疫1次，共免疫3次。

1.4乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）釋放法檢測CTL殺傷活性最后一次免疫后10 d每組殺死6只小鼠，取脾細(xì)胞，用20 μg HCV-CTL體外刺激脾細(xì)胞5 d得效應(yīng)細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞SP2/0-NS3按效靶比50∶1、25∶1、12.5∶1、6.25∶1加載到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，SP2/0細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置靶細(xì)胞SP2/0-NS3自然釋放LDH孔和最大釋放LDH孔，37℃，5%CO2共培養(yǎng)6 h，根據(jù)LDH釋放試劑盒說明書提供公式檢測CTL活性。特異性細(xì)胞殺傷率（%）=（試驗(yàn)組A值-自然釋放組A值）/（最大釋放A值-自然釋放組A值）×100%。

1.5ELISPOT法檢測分泌IFN-γ的細(xì)胞按試劑盒說明書操作:在96孔濾膜板中加100 μl/孔的70%乙醇，室溫放置10 min，倒掉乙醇，用PBS或包被緩沖液洗滌；加100 μl/孔適當(dāng)稀釋的捕獲抗體，4℃包被過夜；傾空板子，用包被緩沖液洗滌2次，加200 μl/孔R(shí)PMI 1640完全培養(yǎng)基，室溫封閉1 h；棄液，加入100 μl/孔用RPMI 1640稀釋的刺激物（抗原或絲裂原）；每孔加入100 μl細(xì)胞（106個(gè)/孔），在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h；將培養(yǎng)物倒掉，拍干，用PBST洗滌3次，加100 μl/孔生物素標(biāo)記的檢測抗體，室溫放2 h。棄液，用PBST洗滌4次，加100 μl/孔親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，室溫放置45 min，洗滌，加100 μl/孔新配置的AEC（3-amino-9-ethyl carbazole）底物液，室溫顯色10-60 min，觀察斑點(diǎn)形成。加200 μl/孔蒸餾水洗板3次終止反應(yīng)。自然干燥，用讀板機(jī)讀板。

1.6ELISA法檢測抗體滴度第一次免疫后20 d、41 d和52 d取血分離血清。用HCV-B包被酶標(biāo)板，免疫血清為一抗，羊抗鼠堿性磷酸酶標(biāo)記的IgG為二抗，采用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA程序操作。ELISA滴度表示為最后稀釋度的對(duì)數(shù)，A≥0.15并且至少是陰性對(duì)照的2倍判定為陽性。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1優(yōu)勢抗原表位合成按照抗原表位合成方法，綜合評(píng)估合成結(jié)果，選取1b型NS5A 2317（PPTTAPPVPPPRRKR），2a型NS5A 2317（PPPRKTPTPPPRRRR），6a型Core 5（PKPQRKTKRNTNRRP）組合成多肽 HCV-B；1b型 NS3 838（FLARLIWWL），2a型P7 769（FLYFVIFFV），6a型NS5B 2972（KLDLSNWFV）組合成多肽HCV-CTL；1b型NS4A 1691（SPAIVPDREVLYQDF），2a型 NS4A 1695（RAVVAPDKEVLYEAF），6a型 NS5A 1989（VCTVLSDFKVWLQAK）組合成多肽HCV-Th。

2.2LDH釋放法檢測聯(lián)合免疫激活的CTL活性SP2/0對(duì)照細(xì)胞未產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，而SP2/0-NS3細(xì)胞經(jīng)HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th和HCVCTL均誘導(dǎo)了特異性的CTL免疫應(yīng)答，當(dāng)效靶比為25∶1和50∶1時(shí)，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2045，F(xiàn)=6338，P均＜0.05），且HCV-CTL+HCV-B+HCVTh聯(lián)合免疫激活的CTL活性高于HCV-CTL單獨(dú)免疫，HCV-CTL單獨(dú)免疫高于PBS空白對(duì)照，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見表1、圖1。

表1　不同免疫原激活的CTL特異性殺傷活性檢測結(jié)果比較

表1　不同免疫原激活的CTL特異性殺傷活性檢測結(jié)果比較

注:＊與PBS空白對(duì)照比較，P均=0.00；#與HCV-CTL免疫原比較，P均=0.00

免疫原　25∶1　50∶1 HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th　42.60±0.82＊#　62.25±0.60＊#HCV-CTL　28.40±1.01＊　31.95±0.93＊PBS空白對(duì)照　9.95±0.82　11.08±0.81 F值　2045　6338 P值　0.00　0.00

圖1　不同免疫原免疫BALB/C小鼠誘導(dǎo)的CTL免疫應(yīng)答

2.3分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量小鼠體內(nèi)經(jīng)細(xì)胞體液聯(lián)合免疫、單獨(dú)體液免疫、單獨(dú)細(xì)胞免疫刺激后分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=5308， P＜0.05）。單獨(dú)體液免疫、單獨(dú)細(xì)胞免疫刺激后分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量均低于細(xì)胞體液聯(lián)合免疫，單獨(dú)體液免疫刺激后分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量高于單獨(dú)細(xì)胞免疫，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見表2、圖2。

表2　不同免疫原在小鼠體內(nèi)刺激產(chǎn)生的分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)比較

表2　不同免疫原在小鼠體內(nèi)刺激產(chǎn)生的分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)比較

注:＊與HCV-B+HCV-Th免疫原比較，P=0.00，0.01；#與HCV-CTL免疫原比較，P=0.00

免疫原　分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)　F值　P值HCV-CTL+HCV-B +HCV-Th　98.0±2.37＊#5308　0.00 HCV-CTL　18.5±0.73＊HCV-B+HCV-Th　15.9±1.12

2.4聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答結(jié)果不同時(shí)間點(diǎn)不同免疫原所誘導(dǎo)的特異性IgG抗體滴度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。不同時(shí)間點(diǎn)用HCVCTL+HCV-B+HCV-Th聯(lián)合免疫和HCV-B+HCVTh免疫所誘導(dǎo)的特異性IgG抗體滴度均顯著高于PBS空白對(duì)照誘導(dǎo)的特異性IgG抗體滴度，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），細(xì)胞體液聯(lián)合免疫與單獨(dú)體液免疫之間特異性IgG抗體滴度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3，圖3。

圖2　重組蛋白抗原在小鼠體內(nèi)刺激產(chǎn)生的IFN-γ分泌細(xì)胞

表3　不同免疫原誘導(dǎo)的特異性IgG抗體滴度比較

表3　不同免疫原誘導(dǎo)的特異性IgG抗體滴度比較

注:＊與 PBS空白對(duì)照比較，P20d均=0.00，P41d均=0.00，P52d均= 0.00；#與HCV-B+HCV-Th免疫原比較，P20d=0.16，P41d=0.64，P52d= 1.00

免疫原　2 0 d　4 1 d　5 2 d H C V -C T L + H C V -B + H C V -T h　3 . 3 3 ± 0 . 1 9＊#　4 . 6 8 ± 0 . 1 6＊#　5 . 2 2 ± 0 . 1 5＊#H C V -B + H C V -T h　3 . 5 2 ± 0 . 3 1＊　4 . 7 2 ± 0 . 1 2＊　5 . 2 2 ± 0 . 1 1＊P B S空白對(duì)照　1 . 1 5 ± 0 . 1 1　1 . 2 2 ± 0 . 0 8　1 . 2 3 ± 0 . 0 8 F值　2 2 3 . 9　1 6 1 7 . 9　2 2 6 6 . 7 P值　0 . 0 0　0 . 0 0　0 . 0 0

圖3　不同免疫原誘導(dǎo)的特異性IgG抗體滴度

3　討論

多表位疫苗也稱雞尾酒式疫苗，是指同時(shí)攜帶多個(gè)目標(biāo)抗原相關(guān)的以及輔助性表位的疫苗。與其他疫苗相比，多表位疫苗能克服主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）分子的遺傳限制，由于一個(gè)特定表位只能被一部分人的MHC分子結(jié)合并呈遞給T細(xì)胞，因此單表位疫苗通常不能在所有個(gè)體中引起預(yù)期的免疫反應(yīng)，而多表位疫苗則可以被多種遺傳背景的MHC分子識(shí)別并結(jié)合，從而得到高效呈遞；多表位疫苗能有效應(yīng)付病原微生物的變異和免疫反應(yīng)中的一些不利因素；另外多表位疫苗在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫方面有獨(dú)特的優(yōu)勢。近年來，多表位疫苗已在多種病原體的疫苗設(shè)計(jì)中得到應(yīng)用［14-16］。本文研究采用生物信息學(xué)方法預(yù)測獲得HCV優(yōu)勢抗原表位，并選取我國常見3種HCV基因型最佳B、CTL、Th表位串聯(lián)成多價(jià)表位，可以最大程度地針對(duì)我國HCV感染者產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，經(jīng)后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)該方法的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了良好的印證。

細(xì)胞免疫和體液免疫在控制HCV感染中均發(fā)揮著重要作用。本文研究將誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的重組抗原HCV-CTL和誘導(dǎo)體液免疫的重組抗原HCV-B聯(lián)合免疫，以期能夠?qū)ふ业侥軌蛴行Мa(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的多肽抗原表位，為HCV重組多肽疫苗的研制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

CTL在病毒清除的過程中是一種重要的效應(yīng)細(xì)胞。本文2.2研究結(jié)果顯示，SP2/0-NS3細(xì)胞經(jīng)HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th和HCV-CTL均誘導(dǎo)了特異性的CTL應(yīng)答，當(dāng)效靶比為25∶1和50∶1時(shí)，HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th聯(lián)合免疫激活的CTL活性高于HCV-CTL單獨(dú)免疫，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均=0.00），表明聯(lián)合免疫增強(qiáng)了HCV-CTL所誘導(dǎo)的特異性CTL應(yīng)答，這對(duì)于清除體內(nèi)已經(jīng)被HCV感染的細(xì)胞非常有利。

IFN-γ是抗病毒感染過程中免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要效應(yīng)因子，只由活化的T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生。本文2.3研究結(jié)果顯示，經(jīng)HCV-CTL+HCV-B+ HCV-Th免疫后的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)明顯高于經(jīng)HCV-CTL及HCV-B+HCV-Th免疫后產(chǎn)生的分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均=0.00），提示細(xì)胞、體液聯(lián)合免疫可明顯增加分泌IFN-γ的效應(yīng)細(xì)胞，從而更有利于病毒的清除。

體液免疫在抗病毒感染過程中發(fā)揮著重要的作用，B細(xì)胞是體液免疫的效應(yīng)細(xì)胞，主要通過分泌特異性抗體來完成免疫過程。本文2.4研究結(jié)果顯示，HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的特異性IgG抗體滴度與HCV-B+HCV-Th免疫誘導(dǎo)的特異性IgG抗體滴度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），且其均高于PBS空白對(duì)照免疫誘導(dǎo)的特異性IgG抗體滴度，表明HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th聯(lián)合免疫誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答，且T細(xì)胞表位抗原在聯(lián)合免疫中不影響B(tài)細(xì)胞表位抗原的免疫原性。另外，研究結(jié)果還顯示，隨著時(shí)間的延長，不同免疫原所誘導(dǎo)的特異性IgG的抗體滴度均有增高的趨勢。

韋三華等［17］等關(guān)于丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗的構(gòu)建及其免疫原性的研究結(jié)果顯示，將含HCV截短 C基因、HVRI模擬表位基因及 NS3、NS4、NS5的優(yōu)勢Th與CTL表位基因串聯(lián)，構(gòu)建的HCV多表位抗原基因疫苗能夠誘發(fā)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的抗體及特異性的CTL應(yīng)答，并且試驗(yàn)組誘導(dǎo)的細(xì)胞因子IFN-γ水平亦高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與本文研究結(jié)果基本一致，提示多表位疫苗確實(shí)可以提高機(jī)體抗原提呈效率，補(bǔ)充單一抗原的相應(yīng)缺陷。

本文研究利用生物信息學(xué)方法篩選出我國HCV主要基因型1b、2a、6a型的優(yōu)勢抗原表位，并組合成HCV-CTL、HCV-B+HCV-Th、HCV-CTL+ HCV-B+HCV-Th抗原多肽，經(jīng)LDH釋放法檢測CTL殺傷活性、ELISPOT法檢測分泌IFN-γ能力、ELISA法檢測抗體滴度驗(yàn)證，獲得了能有效產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的多肽抗原表位，為HCV重組多肽疫苗的研制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（本文編輯:陳淑蓮）

Screening of dominant epitopes of HCV in China

WAN Xiang-hui1，YANG Xi-mei2，ZOU Xue-sen1.1Department of Clinical Laboratory，Cancer Hospital of Jiangxi Province，Nanchang 330029，China2Department of Clinical Laboratory，Children＇s Hospital of Jiangxi Province，Nanchang 330030，China

ObjectiveTo screen the antigen peptides of hepatitis C virus（HCV）which can effectively induce humoral and cellular immunity based on the major genotypes in China.MethodsThe B，cytotoxic T lymphocyte（CTL）and Th cell epitopes of HCV main genotype 1b，2a and 6a in China were predicted by bioinformatics methods.BALB/C mice were immunized with HCV-CTL，HCV-B+HCV-Th and HCV-CTL+ HCV-B+HCV-Th.CTL activity was assessed by LDH assay kit.IFN-γ cells were quantified using ELISPOT kit.Antibody titers were detected by ELISA assay.The results were analyzed statistically.ResultsThere was no specific immune response in control group.There were statistical significance in the difference of CTL activity among three groups at different titer（F=2045，F(xiàn)=6338，Pall＜0.05）.The CTL activity activated by HCVCTL+HCV-B+HCV-Th was higher than that of HCV-CTL，and HCV-CTL was higher than that of PBS，and the differences all had statistical significance（Pall＜0.05）.There was statistical significance in the difference of IFN-γ-secreting cells among HCV-CTL，HCV-B+HCV-Th and HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th immune groups（F=5308，P＜0.05）.There were statistical significance in the differences of IFN-γ-secreting cells between each two groups（Pall＜0.05）.There were statistical significance in the difference of specific IgG titer among HCV-B+HCV-Th group，HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th group and PBS group at different time（Pall＜0.01）.The specific IgG titer induced by HCV-B+HCV-Th and HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th were all higher than that of PBS，and the differences all had statistical significance at different time（Pall＜0.05），but there were no statistical significance between HCV-B+HCV-Th and HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th at different time（P＞0.05）.ConclusionCo-immunization with HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th can induce high effective immune response.HCV-CTL+HCV-B+HCV-Th is potential as a recombinant HCV vaccine.

HCV；Multi-epitope antigen；Genotypes；Co-immunization

江西省科技廳項(xiàng)目（20122BAB215033）

10.3969/j.issn.1674-7151.2015.04.010

（2015-10-16）