升清降濁方對MSG肥胖大鼠脂代謝的影響及機制研究*

杜　娟，張德芹，文　靜，黃春麗，張青霞，周文龍，劉　花

·實驗研究·

升清降濁方對MSG肥胖大鼠脂代謝的影響及機制研究*

杜娟，張德芹，文靜，黃春麗，張青霞，周文龍，劉花

（天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津300193）

［目的］研究升清降濁方（SQJZF）對L-谷氨酸鈉（MSG）肥胖大鼠脂代謝的影響及其機制研究。［方法］復制MSG肥胖大鼠模型，隨機分為模型組、陽性藥羅格列酮組、陽性藥非諾貝特組、SQJZF高劑量組（含生藥6 g/kg）、SQJZF中劑量組（含生藥3 g/kg）、SQJZF低劑量組（含生藥1.5 g/kg）；另取正常組大鼠8只。連續(xù)給藥50 d后，分別檢測大鼠肝臟脂質(zhì)和血清游離脂肪酸的含量；實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測藥物對MSG大鼠肝臟中過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR α）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、載脂蛋白A-Ⅴ（ApoA-Ⅴ）、載脂蛋白C-Ⅲ（ApoC-Ⅲ）的基因表達水平。［結(jié)果］模型組MSG大鼠肝臟總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）和血清游離脂肪酸（NEFA）含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），肝臟高密度脂蛋白（HDL-C）含量顯著降低（P＜0.01）；肝臟PPARα、LPL基因的相對表達量降低，ApoA-Ⅴ基因的相對表達量顯著降低（P＜0.01），ApoC-Ⅲ基因的相對表達量升高；給藥50 d后，各給藥組肝臟TC、TG、LDL-C和NEFA含量降低（P＜0.05或P＜0.01），肝臟HDL-C含量升高（P＜0.05或P＜0.01）；對相關(guān)基因的相對表達均有一定的調(diào)節(jié)作用。［結(jié)論］SQJZF對MSG大鼠可能通過激活PPAR受體調(diào)控脂蛋白代謝來控制MSG肥胖大鼠脂代謝紊亂。

升清降濁方；L-谷氨酶鈉肥胖大鼠；脂代謝

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.11.08

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）屬于非甾體類核受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控糖、脂代謝多種關(guān)鍵基因的表達［1］，有3種不同的亞型［2］，分別具有不同的組織分布和代謝調(diào)節(jié)功能［3］。其中，過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）是機體脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)因子，主要表達于嚙齒類動物的肝臟，其次是骨骼肌與脂肪。以氯貝特和非諾貝特為代表的貝特類PPARα激動劑作為降脂藥已經(jīng)應(yīng)用于臨床達數(shù)十年，通過PPARα調(diào)節(jié)脂蛋白氧化基因的表達是貝特類降脂藥的分子作用靶點［4］。本次實驗通過復制L-谷氨酸鈉（MSG）肥胖大鼠，檢測MSG大鼠肝臟中的脂質(zhì)水平和與脂蛋白相關(guān)基因的表達水平，來研究升清降濁方對MSG肥胖大鼠脂代謝的影響及機制研究，并且為進一步確定升清降濁方調(diào)脂機制做鋪墊。

1　材料

1.1實驗動物Wistar孕鼠24只，由天津?qū)嶒瀯游镏行奶峁细褡C號SCXK（津）2010-0002。孕鼠單籠飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學實驗動物中心，屏障環(huán)境，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%。

1.2飼料高脂飼料配方為10%豬油，1.5%膽固醇，0.25%膽鹽，10%蔗糖，78.25%基礎(chǔ)飼料，由北京諾康源生物科技有限公司提供。

1.3藥物升清降濁方：棕色干膏粉，出膏率為100g生藥含干膏粉11.11 g（每克干膏粉的生藥含量為9.00 g），批號：2010911，由天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院藥學部提供。陽性對照藥羅格列酮［葛蘭素史克（天津）有限公司，批號：10125188］，陽性對照藥非諾貝特（Laboratoires FOURNIRE S.A.，批號：15135），MSG（美國Sigma-Aldrich，批號：BCBF3631V）。

1.4試劑膽固醇（TC）試劑盒（批號：111241），甘油三酯（TG）試劑盒（批號：114871），以上所用試劑盒均由中生北控生物科技股份有限公司提供。游離脂肪酸（NEFA）試劑盒（日本W(wǎng)ako公司，批號：DBJ5786），Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號：l15596018），SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（美國Applied Biosystems公司，批號：4367659），High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit試劑盒（美國Applied Biosystems公司，批號：4368814），引物合成（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司，批號：201205）。

1.5實驗儀器ALLEGRA-64R高速離心機（美國BECKMAN COULTER有限公司），Infinite M200微量多功能讀板機（瑞士Tecan公司），DU-530紫外分光光度計（美國BECKMAN COULTER有限公司），F(xiàn)lexStation3多功能微孔板分析儀（美國Molecular Devices公司），PC-1000 PCR逆轉(zhuǎn)錄儀（美國PERKIN ELMER儀器公司），7500 Real-Time PCR system實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

2　方法

2.1模型的建立取Wistar孕鼠24只，飼養(yǎng)于清潔級動物房。新生鼠于出生第2天起，皮下注射MSG，注射劑量3 g/kg［5］，正常組注射等量生理鹽水，每隔1 d注射1次，連續(xù)7次。21 d后斷乳，MSG組及正常組均按雌雄分籠飼養(yǎng)，正常組給予普通飼料，MSG模型組給予高脂飼料。定期記錄體質(zhì)量，觀察體型變化。第8周時，禁食不禁水8 h檢測空腹血脂的含量及糖耐量2 h后血糖，以血脂含量和糖耐量2 h血糖高于正常組為成模標準。

2.2分組給藥篩選成模雄性大鼠48只，采用隨機區(qū)組法隨機分為模型組、羅格列酮組、非諾貝特組、升清降濁方高、中、低劑量組（含生藥6、3、1.5 g/kg）6組，每組8只。另取Wistar雄性大鼠8只為正常組。羅格列酮組給藥劑量為5 mg/kg［6］，非諾貝特組給藥劑量為100 mg/kg［7］，SQJZF高劑量組給藥劑量為含生藥6 g/kg，SQJZF中劑量組給藥劑量為含生藥3 g/kg，SQJZF低劑量組給藥劑量為含生藥1.5 g/kg，灌胃體積為10 mL/kg，正常組和模型組灌胃同體積5%阿拉伯膠水溶液。每日上午灌胃1次，連續(xù)灌胃50 d。每周稱體質(zhì)量1次，給藥50d后，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整用藥劑量。

2.3標本采集給藥8周后大鼠禁食（不禁水）8 h，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈采血并離心取血清，迅速剖去肝臟和骨骼肌，液氮速凍后一并移入-80℃冰箱冷貯備用。

2.4檢測方法

2.4.1肝臟脂質(zhì)檢測取肝臟組織300 mg，生理鹽水洗凈，準確稱取重量，加9倍量（g/mL）的乙醇-丙酮（1∶1）溶液，組織勻漿后，靜置提取24 h，離心，取上清，應(yīng)用TECAN多功能讀板機采用終點法505 nm波長下讀取吸光度（A），計算總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）和低密度脂蛋白（LDL-C）的含量，并換算到單位為mg/g組織。

2.4.2血清游離脂肪酸檢測采用酶學比色法（ACS·ACOD）550 nm波長下讀取吸光度（A），并計算血清NEFA含量。

2.4.3RT-PCR檢測基因的表達肝臟組織研磨后，Trizol法提取總RNA，檢測RNA樣品純度符合實驗要求。每10 μL體系2 000 ng總RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：25℃，10 min；37℃，120 min；85℃，5 min，4℃，∞，-20℃保存。取2 μL cDNA進行實時定量PCR，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，加入上下游引物各0.5 μL，SYBR Green PCR Master Mix10 μL，無酶雙蒸水補足至總反應(yīng)體系20 μL，于PCR儀中進行反應(yīng)。用2-△△CT方法計算各基因的表達水平。引物序列見表1。

表1　RT-PCR引物序列Tab.1　Primer sequences for real-time PCR

2.5統(tǒng)計方法采用SPSS18.0軟件分析，計量資料均以均數(shù)±標準差（x±s）表示，正態(tài)分布計量資料組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，偏態(tài)分布計量資料組間比較采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3　結(jié)果

3.1對血清NEFA的影響模型組MSG大鼠血清NEFA含量與正常組相比顯著升高（P＜0.01）；給藥50 d后，與模型組MSG大鼠相比，各給藥組均顯著降低血清中NEFA的含量（P＜0.01）。見表2。

3.2對肝臟脂質(zhì)的影響模型組MSG大鼠肝臟TC、TG和LDL-C的含量與正常組相比顯著升高（P＜0.01），HDL-C的含量與正常組相比顯著降低（P＜0.01）；給藥50 d后，與模型組MSG大鼠相比，各給藥組均顯著降低肝臟TC、TG和LDL-C的含量（P＜0.05或P＜0.01），羅格列酮組和SQJZF高、中和低劑量組均升高肝臟HDL-C的含量（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

3.3對脂蛋白代謝相關(guān)基因表達的影響模型組MSG大鼠肝臟PPARα，LPL基因的相對表達量降低，載脂蛋白A-V（ApoA-Ⅴ）基因的相對表達量顯著降低（P＜0.01），載脂蛋白C-Ⅲ（ApoC-Ⅲ）基因的相對表達量升高；給藥50 d后，與模型組MSG大鼠相比，非諾貝特組，SQJZF高、中和低劑量組均顯著升高肝臟PPARα基因的相對表達量（P＜0.01）；羅格列酮組、非諾貝特組，SQJZF中、低劑量組均升高肝臟LPL基因的相對表達量（P＜0.01）；羅格列酮組，SQJZF高、中劑量組均升高肝臟ApoA-Ⅴ基因的相對表達量（P＜0.01）；非諾貝特組，SQJZF中、低劑量組均降低肝臟ApoC-Ⅲ基因的相對表達量（P＜0.01）。見表3。

表2　給藥50 d后MSG大鼠肝臟脂質(zhì)和血清NEFA含量（±s）Tab.2　Contents of liver lipid and NEFA in MSG rats after 50 days of administration（±s）

表2　給藥50 d后MSG大鼠肝臟脂質(zhì)和血清NEFA含量（±s）Tab.2　Contents of liver lipid and NEFA in MSG rats after 50 days of administration（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別正常組模型組羅格列酮組非諾貝特組SQJZF高劑量組SQJZF中劑量組SQJZF低劑量組動物數(shù)8 8 8 8 8 8 8給藥劑量TC（mg/g組織）TG（mg/g組織）LDL-C（mg/g組織）HDL-C（mg/g組織）NEFA（mEq/mL）-10.15±1.85**37.01±10.81**07.74±02.02**14.54±2.55**0.57±0.11** -17.44±3.0087.20±11.9518.33±02.6005.42±2.641.09±0.11 005 mg/kg12.84±2.75**56.04±16.00**13.25±07.74**09.40±4.19*0.69±0.22** 100 mg/kg13.84±3.63**43.95±13.90**15.49±18.83*07.86±3.260.64±0.11**含生藥6 g/kg12.50±2.78**56.14±18.70**13.47±13.25**08.85±3.10*0.87±0.15**含生藥3 g/kg12.85±1.94**55.45±15.60**13.88±15.49**10.03±2.26**0.83±0.15**含生藥1.5 g/kg11.88±1.89**40.17±10.72**11.15±13.47**07.95±2.19*0.76±0.12**

表3　給藥50 d后MSG大鼠肝臟脂蛋白代謝相關(guān)基因的表達（±s）Tab.3　Relative expression of lipoprotein metabolism in the liver in MSG rats after 50 days of administration（±s）

表3　給藥50 d后MSG大鼠肝臟脂蛋白代謝相關(guān)基因的表達（±s）Tab.3　Relative expression of lipoprotein metabolism in the liver in MSG rats after 50 days of administration（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別正常組模型組羅格列酮組非諾貝特組SQJZF高劑量組SQJZF中劑量組SQJZF低劑量組動物數(shù)8 8 8 8 8 8 8給藥劑量PPARα基因LPL基因ApoA-Ⅴ基因ApoC-Ⅲ基因相對表達量相對表達量相對表達量相對表達量-1.01±0.1201.02±0.241.00±0.02**1.01±0.18 -0.84±0.0900.58±0.200.61±0.051.08±0.14 05 mg/kg1.02±0.0801.61±0.20**0.91±0.09**0.68±0.22 100 mg/kg1.47±0.12**21.54±2.84**0.25±0.12**0.22±0.12**含生藥6 g/kg1.56±0.23**00.57±0.370.87±0.06**0.95±0.06含生藥3 g/kg1.93±0.17**01.51±0.21**1.49±0.15**0.67±0.10**含生藥1.5 g/kg2.09±0.13**04.72±0.54**0.41±0.140.69±0.11**

4　討論

升清降濁方來源于臨床經(jīng)驗方，由荷葉、桑葉、山楂葉等中藥組成，該方在長期的臨床應(yīng)用中，對糖尿病前期合并高脂血癥患者具有顯著療效。本課題組前期研究中表明，升清降濁方對實驗性大鼠、小鼠和KK-Ay小鼠均有調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用［8-11］，并且對高血脂家兔糖脂代謝以及組織病理學均具有調(diào)節(jié)作用［12-14］。本次實驗選用MSG大鼠作為實驗動物模型。20世紀70年代，由Bunyan開始研究谷氨酸單鈉鹽對新生鼠脂質(zhì)代謝及內(nèi)分泌的影響。2 d齡Wistar大鼠皮下注射谷氨酸單鈉鹽［15］，成年后可形成嚴重的向心性肥胖和糖脂代謝紊亂，導致明顯的高胰島素血癥、高血脂、脂肪肝并伴有糖耐量異常和胰島素抵抗，是一種具有典型代謝綜合征特征的實驗動物模型［16］。

本次實驗顯示，給藥50 d后，MSG大鼠肝臟中TC、TG和LDL-C水平顯著降低，HDL-C水平顯著升高。脂蛋白代謝相關(guān)基因表達水平均升高。PPARα與TC、TG、HDL和LDL-C的代謝密切相關(guān)。大量研究證明，PPARα激動劑貝特類降脂藥非諾貝特的主要治療作用是通過降低機體內(nèi)極低密度脂蛋白（VLDL）的產(chǎn)生和增加TG的代謝，間接的減少LDL、HDL以及清除肝臟及血液中的TC。貝特類降脂藥非諾貝特對VLDL與乳糜微粒（CM）中的TG水解作用很強，因為PPARα激活后，可以上調(diào)脂蛋白脂肪酶（LPL）在肝臟、骨骼肌和脂肪中的活性及表達［17］。LPL是外周血管TG的水解酶關(guān)鍵因子，它可以加速含TG豐富的脂蛋白的分解，它的失活將會導致嚴重的高TG血癥和低HDL血癥，即所謂的高脂血癥。然而以ApoC-Ⅲ為代表的載脂蛋白C類能夠抑制LPL的活性及表達［18］，已有研究證實，ApoC-Ⅲ的高表達小鼠TG大幅增高。PPARα激動劑貝特類藥物在動物和人的治療中都可以減少ApoC-Ⅲ的合成，因此，有效地增加VLDL的降解以及空腹血清TG的水平，進一步提高LPL的活性?？傊?，PPARα可以通過其轉(zhuǎn)錄激活脂蛋白的作用，減少TG的產(chǎn)生，增加TG的降解，促進HDL的代謝和TC外流到肝臟，從而使全身血脂維持正常水平，從而達到調(diào)控脂代謝的作用。

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（本文編輯：高杉，滕曉東）

Effects of Shengqing Jiangzhuo formula to improve the insulin sensitivity of MSG rats

DU Juan，ZHANG De-qin，WEN Jing，HUANG Chun-li，ZHANG Qing-xia，ZHOU Wen-long，LIU Hua
（Traditional Chinese Medicine Research Institute，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To study the mechanisms and effects of Shengqing Jiangzhuo formula（SQJZF）to improve the lipid metabolism of MSG rats.［Methods］Copy the MSG obese rat models，which were randomly divided into model group，rosiglitazone group，fenofibrate group，three dose of SQJZF.Then choose 8 normal rats as the normal control group.Measure the levels of liqid in liver and the level of NEFA in serum after administration for 50 days.Real-time PCR detect the expression level of PPAR，LPL，ApoA-Ⅴ，A poC-Ⅲin liver.［Results］Compared with the normal group，the model group improved the level of TC，TG，LDL-C in liver and the level of NEFA in serum and decreased the level of HDL-C in liver significantly（P＜0.05 or P＜0.01），and decreased the expression of PPAR，LPL，ApoA-Ⅴsignificantly（P＜0.01），and improved the expression of ApoC-Ⅲ.Compared with the model group，each of groups had some improvements of the level of liqid in liver and the level of NEFA and the level of genes expression.［Conclusion］SQJZF improve the lipid metabolism disorders in MSG rats which by activating the genes expression of PPAR.

Shengqing Jiangzhuo formula；MSG rat；lipid mechanism

R589.2

A

1672-1519（2015）11-0668-04

國家自然科學基金項目（81173373）。

杜娟（1987-），女，碩士研究生，從事中藥基本理論及臨床應(yīng)用研究。

張德芹，E-mail：deqin123@163.com。

（2015-06-15）