突變型P53蛋白在肺腺癌中的表達及其臨床意義

卞春安 李忠佑 許有濤 王潔 許林 沈洪兵

TP53基因作為一種非常經(jīng)典和重要的抑癌基因，一直以來受到廣泛的關(guān)注和研究[1]。其編碼的P53蛋白是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，可以通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄來應(yīng)對基因毒性應(yīng)激、癌基因信號激活以及DNA損傷等不利因素。近來的全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome wide association study, GWAS）提示TP53基因是人類惡性腫瘤中突變頻率最高的基因之一[2]。相對于其他抑癌基因突變后僅僅是喪失了抑癌功能，TP53基因突變有其獨特的特性，即突變的基因獲得了新的促癌功能（gain of function, GOF）[3]。目前已有許多有關(guān)TP53突變在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中作用的研究，但結(jié)論尚不一，而且單獨對TP53突變在肺腺癌中作用的研究則更為少見[4-7]。雖然同為NSCLC，肺鱗癌和肺腺癌的基因突變譜是完全不同的，研究[8-10]發(fā)現(xiàn)TP53、EGFR、KARS、ALK、PIK3CA、SMAD4等基因是肺腺癌的常見的驅(qū)動基因，因此將肺鱗癌和肺腺癌分別研究更為合理。由于突變的TP53基因編碼的P53蛋白半衰期較長，而野生型TP53基因編碼的P53蛋白半衰期極短，所以突變型P53蛋白在細胞核內(nèi)積累從而可以被免疫組化法檢測，而野生型P53蛋白無法被免疫組化法檢測到[11]。本研究利用免疫組化SP法檢測突變型P53蛋白在肺腺癌組織中的表達情況，分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，探討突變型P53蛋白在肺腺癌中的作用及其對預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 標本及病例資料來源 收集南京醫(yī)科大學附屬江蘇省腫瘤醫(yī)院2007年1月-2009年3月期間手術(shù)切除并經(jīng)術(shù)后病理確診為肺腺癌的石蠟標本120例。所有納入研究的患者均有完整的病歷及隨訪資料。隨訪期間死于其他疾病的患者不被納入研究。所有患者接受的均為根治性手術(shù)，所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。本研究經(jīng)江蘇省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 免疫組化SP法測定突變型P53蛋白表達 鼠抗人突變型P53單克隆抗體購自Santa Cruz公司（克隆號clone SC126），SP試劑盒購自北京中山公司。染色方法采用常規(guī)SP法，突變型P53一抗工作濃度為抗體原液稀釋1,000倍。采用生物素標記的二抗進行染色。用已知的陽性胰腺癌組織作為陽性對照，使用PBS緩沖液代替一抗做為陰性對照。

1.3 免疫組化結(jié)果判定 突變型P53蛋白的表達主要定位于細胞核，以胞核中有棕褐色顆粒染色為陽性（圖1）， 每個切片于高倍鏡下隨意取5個不重復(fù)視野計數(shù)，計數(shù)所有細胞，表達強度按陽性細胞所占百分比進行判斷，取其平均值，以陽性細胞數(shù)≤10%為陰性，陽性細胞數(shù)＞10%為陽性。免疫組化的結(jié)果判定由兩個高年資病理科醫(yī)生共同作出。

1.4 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組間率的比較采用χ2檢驗，單因素生存分析采用Kaplan-Meier法（Log-rank檢驗），多因素生存分析采用Cox風險比例模型。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征及預(yù)后 所有納入研究的患者中男性58例，女性62例。手術(shù)時的平均年齡為59.4歲。截止到隨訪時間（2014年3月）有20.8%（25例）的患者仍存活。采用壽命表法統(tǒng)計出患者的1年、3年、5年的生存率分別為61%、39%、33%。腫瘤大小≤3 cm（T1）的占20%（24例），＞3 cm≤7 cm（T2）的占60.8%（73例），＞7 cm（T3、T4）的占19.2%（23例）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的占40.8%（49例）。腫瘤高分化的占26.7%（32例）、中分化的占34.1%（41例）、低分化的占39.2%（47例）。僅有10.8%（13例）患者有胸膜侵犯。臨床分期為I期、II期和III期的患者分別占30.8%（37例）、39.2%（47例）和30.0%（36例）（表1）。

2.2 突變型P53蛋白的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系 免疫組化法檢測突變型P53蛋白在肺腺癌組織中的表達率為63.3%（76/120）?？ǚ綑z驗顯示突變型P53蛋白的表達與患者腫瘤大?。≒=0.041）和臨床病理分期（P=0.025）有相關(guān)（圖1）。

2.3 突變型P53蛋白的表達及臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系運用Kaplan-Meier法對120例患者進行單因素生存分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤的大?。≒=0.031）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.001）、臨床病理分期（P＜0.001）、突變型P53蛋白的表達（P=0.038）與患者的總生存期密切相關(guān)（圖2）。對單因素分析中P＜0.05的因素進一步進行Cox風險比例模型多因素，結(jié)果顯示僅有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.014）為肺腺癌總體生存期的獨立預(yù)后因素（表2）。

表1 突變型P53的表達患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab1 Mutant P53 expression in relation to clinicopathological parameters (n=120)

3 討論

肺癌是當今世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[12]，并且流行病學統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)肺癌中的肺腺癌發(fā)病率越來越高，目前已經(jīng)取代肺鱗癌成為發(fā)病率最高的NSCLC[13]。長期以來，以肺鱗癌和肺腺癌為代表的NSCLC的預(yù)后無明顯改善，直到近十年來，隨著分子生物學的進展，EGFR、KARS、TP53等一批肺腺癌驅(qū)動基因被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[14]，導(dǎo)致一些靶向治療藥物的出現(xiàn)，極大地改善了肺腺癌患者的預(yù)后[15,16]。人類TP53基因定位于17號染色體p13，全長16 kb-20 kb，含有11個外顯子，轉(zhuǎn)錄2.8 kb的mRNA，編碼蛋白質(zhì)為P53，是一種核內(nèi)磷酸化蛋白。TP53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因。過去一直把它當成一種癌基因，直至1989年才發(fā)現(xiàn)起癌基因作用的是突變的P53，后來證實野生型P53是一種抑癌基因，在正常情況下，細胞中野生型P53蛋白的含量很低，且半衰期極短，所以很難檢測出來。一直以來，TP53基因都是生物學界研究的熱點，有關(guān)野生型的TP53基因的抑癌作用和突變型的TP53的致癌功能，已經(jīng)得到公認。眾多臨床證據(jù)[17]也顯示TP53基因突變與多種惡性腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。盡管如此，突變的TP53在肺癌中的意義尚不明確。Ding等[18]發(fā)現(xiàn)45%的肺腺癌患者的TP53基因存在突變，而本研究中肺腺癌組織中測得的TP53突變率為63.3%，較其報道的突變率略高。Ahn等[11]報道TP53的突變與NSCLC的預(yù)后無關(guān)。而另一些報道[19-22]則認為TP53突變是NSCLC的不良預(yù)后標志。本研究中亦發(fā)現(xiàn)TP53的突變與患者不良的總生存期預(yù)后有關(guān)，但并不是獨立預(yù)后因素，猜測可能是因TP53基因是一個關(guān)鍵基因，調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄表達、作用及機制較為多樣復(fù)雜所致。另外，有報道[23,24]在動物實驗中發(fā)現(xiàn)含有TP53突變的小鼠腫瘤更具侵襲性更容易轉(zhuǎn)移。但本研究中未發(fā)現(xiàn)TP53突變與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，僅與腫瘤的大小及臨床病理分期相關(guān)。對于肺癌中TP53突變的作用各個研究得出的結(jié)論不一，我們認為可能與分子的異質(zhì)性、TP53突變的各種不同基因型以及實驗采用的不同方法、不同分組、樣本量的大小不同有關(guān)。故今后需要進行更大樣本量的實驗，更加完善的實驗方法，以取得較為可靠一致的結(jié)論。

表2 患者總生存期的單因素及多因素分析Tab2 Univariate and multivariate analyses of overall survival (n=120)

圖1 突變型P53在肺腺癌組織中的免疫組化（SP法，×100）。A：突變型P53陽性表達（細胞核棕黃色染色）；B：突變型P53陰性表達。Fig1 Mutant P53 expression in lung adenocarcinoma by immunochemistry (SP, ×100). A: Positive mutant P53 expression (staining was detected in nucleus); B: Negative mutant P53 expression.

綜上所述，本研究應(yīng)用免疫組化法對120例肺腺癌患者的突變型P53蛋白進行了檢測，發(fā)現(xiàn)其與患者的腫瘤大小，臨床病理分期及總生存期有關(guān)。本研究結(jié)果提示TP53突變是肺腺癌患者不良預(yù)后的一個重要因素，未來值得對相關(guān)機制進一步進行研究。

圖2 突變型P53蛋白表達與總生存期的生存曲線Fig2 The overall survival curve of patients according to mutant P53 expression