補(bǔ)陽還五湯對(duì)家兔易損斑塊內(nèi)新生血管的影響研究*

龐曉麗，楊　琳，曾文赟，索艷榮，張?jiān)粕?，姜希?/p>

補(bǔ)陽還五湯對(duì)家兔易損斑塊內(nèi)新生血管的影響研究*

龐曉麗，楊琳，曾文赟，索艷榮，張?jiān)粕＞?/p>

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津300193）

［目的］研究補(bǔ)陽還五湯對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管的影響及機(jī)制。［方法］選取50只雄性新西蘭白兔為研究對(duì)象，將其隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組，12周后處死。取斑塊組織蘇木精-伊紅（HE）染色評(píng)估斑塊破裂出血情況；取冰凍斑塊組織，采用免疫熒光染色，評(píng)估血管密度情況；采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）及蛋白印記測(cè)定血中及斑塊內(nèi)堿性成纖維生長因子（bFGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板源性生長因子（PDGF）表達(dá)情況。［結(jié)果］補(bǔ)陽還五湯組斑塊破裂數(shù)明顯少于模型組（P＜0.05）斑塊內(nèi)bFGF、PDGF表達(dá)與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。［結(jié)論］補(bǔ)陽還五湯具有穩(wěn)定易損斑塊的作用，其機(jī)制可能與增加斑塊內(nèi)bFGF、PDGF表達(dá)，促進(jìn)血管成熟有關(guān)。

動(dòng)脈粥樣硬化；易損斑塊；新生血管；補(bǔ)陽還五湯

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.11.09

易損斑塊是造成急性冠脈綜合征的主因，病理特點(diǎn)為豐富的脂核、薄的纖維帽和大量炎細(xì)胞浸潤［1-2］。近年來研究顯示，斑塊內(nèi)存在不成熟新生血管，這類血管通透性和脆性增加，容易導(dǎo)致斑塊內(nèi)炎細(xì)胞大量浸潤和血腫，進(jìn)而形成易損斑塊［3-4］。因此，促進(jìn)斑塊內(nèi)新生血管成熟有利于斑塊穩(wěn)定。補(bǔ)陽還五湯具有補(bǔ)氣活血、通經(jīng)活絡(luò)的功效，臨床上廣泛用于缺血性心、腦血管病的治療?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，該方可通過改善缺血區(qū)血供保護(hù)心、腦功能［5-8］。故本實(shí)驗(yàn)通過建立家兔動(dòng)脈粥樣硬化（AS）模型，研究補(bǔ)陽還五湯對(duì)斑塊內(nèi)新生血管的影響及機(jī)制。

1　材料與方法

1.1藥物制備補(bǔ)陽還五湯藥物購于同仁堂藥業(yè)（北京），其中黃芪125 g，川芎3 g，當(dāng)歸6 g，赤芍5 g，桃仁3 g，紅花3 g，地龍3 g。將上述藥物用水煎煮2次，時(shí)間30 min，合并煎煮液后濃縮成含生藥相當(dāng)于1 kg/L。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選取健康新西蘭白兔50只，體質(zhì)量2.6～3.0 kg，3～4月齡（國家衛(wèi)生研究院提供）。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將家兔分為3組：假手術(shù)組10只、模型組20只、補(bǔ)陽還五湯組20只。模型組和補(bǔ)陽還五湯組給予高脂飲食4周，4周后行腹主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)，繼續(xù)高脂飲食4周，繼而兩組改為正常飲食4周。補(bǔ)陽還五湯組在正常飲食的基礎(chǔ)上給補(bǔ)陽還五湯灌胃，每日2次，連續(xù)4周；假手術(shù)組僅切開皮膚，分離腹主動(dòng)脈后即縫合，正常飲食10周。干預(yù)結(jié)束后給予兩次藥物觸發(fā)斑塊破裂：1）在處死動(dòng)物前24 h和48 h分別給予以蝰蛇毒0.15 mg/kg腹膜下注射。2）于30 min后耳緣靜脈注射組胺0.02 mg/kg。

1.3觀察方法與指標(biāo)1）處死家兔后取腹主動(dòng)脈斑塊處蘇木精-伊紅（HE）染色評(píng)價(jià)斑塊破裂情況。2）取斑塊組織冰凍切片，采用血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（CD31）和異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記，免疫熒光染色血管內(nèi)皮細(xì)胞，評(píng)估血管密度情況。3）取家兔外周血，離心后取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）評(píng)價(jià)外周血中堿性成纖維生長因子（bFGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、血小板源性生長因子（PDGF）含量。4）取斑塊組織提取蛋白，采用蛋白印跡方法評(píng)價(jià)斑塊內(nèi)bFGF、VEGF、PDGF表達(dá)情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1斑塊破裂情況模型組和補(bǔ)陽還五湯組均形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，其中模型組形成的粥樣斑塊具有較大脂核和薄的纖維帽。藥物觸發(fā)后，模型組有14只發(fā)生斑塊破裂出血，補(bǔ)陽還五湯組僅有7只出血斑塊破裂，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見表1。

表1　兩組家兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂情況比較Tab.1　Comparison of the ruptured plaque numbers of rabbits between two groups

2.2斑塊內(nèi)血管情況假手術(shù)組未見血管，模型組和補(bǔ)陽還五湯組可見新生血管，如圖1，兩組在血管密度方面沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。

圖1　各組斑塊內(nèi)血管情況比較（×100）Fig.1 Comparison of the microvessels in plaque of each group（×100）

表2　各組斑塊內(nèi)新生血管密度比較（±s）Tab.2　Comparison of the density of microvessels in plaque of each groups（±s）

表2　各組斑塊內(nèi)新生血管密度比較（±s）Tab.2　Comparison of the density of microvessels in plaque of each groups（±s）

注：與模型組比較，*P＞0.05。

組別動(dòng)物數(shù)新生血管密度（根/mm2）假手術(shù)組100模型組1017.55±0.76*補(bǔ)陽還五湯組1016.27±0.52*

2.3外周血中bFGF、VEGF、PDGF含量補(bǔ)陽還五湯組在VECF、PDGF、bFGF外周血含量方面與假手術(shù)組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），然而與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3　各組外周血中血管生成因子含量測(cè)定比較±s）Tab.3　Comparison of the angiogenesis factors in peripheral blood in each group±s）

表3　各組外周血中血管生成因子含量測(cè)定比較±s）Tab.3　Comparison of the angiogenesis factors in peripheral blood in each group±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＞0.05。

組別假手術(shù)組模型組補(bǔ)陽還五湯組動(dòng)物數(shù)10 10 10 VEGF（ng/L）PDGF（ng/L）bFGF（ng/L）26.03±9.66070.75±08.66207.50±54.13 31.78±8.35083.69±20.76227.83±78.87 31.71±6.75*△105.09±22.18*#234.08±80.99*#

2.4斑塊內(nèi)bFGF、VEGF、PDGF表達(dá)3組VEGF表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在bFGF、PDGF表達(dá)方面補(bǔ)陽還五湯組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2　各組VEGF、bFGF、PDGF表達(dá)情況Fig.2Comparison of the protein expression of VEGF，bFGF，PDGF in each group

3　討論

3.1補(bǔ)陽還五湯可抑制斑塊破裂出血中醫(yī)認(rèn)為：動(dòng)脈粥樣硬化（AS）證候要素主要有血瘀、痰濁、氣虛，為本虛標(biāo)實(shí)之病，標(biāo)實(shí)為血瘀、痰濁，本虛為氣虛［9-10］，故臨床上常以補(bǔ)氣、活血藥物治療此病。補(bǔ)陽還五湯是收載于《醫(yī)林改錯(cuò)》中的經(jīng)典方劑，全方由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁等7味中藥組成，具有益氣、活血、通絡(luò)之功效［11］。研究顯示，該藥對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有一定的療效［12-13］。由表1可以看出，補(bǔ)陽還五湯能夠減少家兔斑塊破裂出血，對(duì)于控制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展有一定作用。

3.2補(bǔ)陽還五湯抑制斑塊破裂與促進(jìn)斑塊內(nèi)新生血管成熟有關(guān)新生血管成熟的標(biāo)志是基底膜的形成，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)周細(xì)胞的募集，從而形成有周細(xì)胞包繞的穩(wěn)定的血管［14-15］。研究顯示，VEGF調(diào)控血管發(fā)芽，而PDGF-B和bFGF則在調(diào)控周細(xì)胞募集方面發(fā)揮重要作用［15-16］。內(nèi)皮細(xì)胞分泌的PDGF-B與周細(xì)胞表面的受體PDGF受體-β（PDGFR-β）結(jié)合，促進(jìn)周細(xì)胞的增殖與遷移，bFGF可協(xié)調(diào)PDGF-B/PDGFR-β進(jìn)一步強(qiáng)化新生血管成熟［17］。近年來研究表明AS斑塊內(nèi)存在大量不成熟新生血管，由于其血管滲透性強(qiáng)，血液中的炎癥因子可順利進(jìn)入斑塊內(nèi)，進(jìn)而引發(fā)斑塊不穩(wěn)定［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯組和模型組斑塊內(nèi)均有新生血管（如圖2所示），然而補(bǔ)陽還五湯組斑塊破裂卻少于模型組，說明兩組斑塊內(nèi)血管在成熟度方面存在差異。故本研究采用ELISA和蛋白印跡等方法，評(píng)估各組血管生成因子VEGF、bFGF、PDGF的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與模型組比較補(bǔ)陽還五湯組并不能有效增加外周血中VEGF、bFGF、PDGF的含量，而在斑塊內(nèi)bFGF、PDGF的表達(dá)卻明顯增加。由此可以說明，一方面，補(bǔ)陽還五湯在治療AS時(shí)只針對(duì)斑塊內(nèi)血管，并不對(duì)全身血管新生產(chǎn)生影響，從側(cè)面印證了它的安全性；另一方面，補(bǔ)陽還五湯通過增加斑塊內(nèi)bFGF、PDGF表達(dá)，促進(jìn)新生血管成熟與穩(wěn)定，進(jìn)而穩(wěn)定斑塊。

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（本文編輯：馬英，滕曉東）

Research the mechanism of Buyang Huanwu decoction on angiogenesis in vulnerable plaque in rabbits

PANG Xiao-li，YANG Lin，ZENG Wen-yun，SUO Yan-rong，ZHANG Yun-sha，JIANG Xi-juan
（College of Combination of Traditional Chinese and Western Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To explore the mechanism of Buyang Huanwu decoction（BYHWD）on angiogenes in vulnerable plaque in rabbits.［Methods］The vulnerable plaque model was reproduced by operation on abdominal aorta endothelium for inducing sacculus pull injury with the foraging with high cholesterol lipid feeding.Rabbits were divided into three groups:model group，sham-operation group and BYHWD group.The experiment lasted for 12 weeks.After killing at the end of experiment，the samples of abdominal aorta were collected for HE staining to accounting the number of rupture plaques，using immunofluorescence staining to evaluate the density of microvessels，detecting the protein content of VEGF，bFGF，PDGF in plaque and evaluating the content of VEGF，bFGF，PDGF in the serum of peripheral blood.［Results］It was found that the number of plaque rupture in BYHWD group was obviously less than model group by HE observation（P＜0.05）.The expression of bFGF，PDGF in plaque in BYHWD was statistically significant（P＜0.05），compared with model group and sham-operated group.［Conclusion］BYHWD can stable the vulnerable plaque，and the mechanism may be related to increasing the expression of bFGF，PDGF and then promoting the microvessels maturation in plaque.

atherosclerosis；vulnerable plaques；angiogenesis；Buyang Huanwu decoction

R743.3

A

1672-1519（2015）11-0672-03

國家自然基金資助項(xiàng)目（81102699，81173413，81202797）。

龐曉麗（1976-），女，在職博士，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合心血管基礎(chǔ)研究。

姜希娟，E-mail:1371409370@qq.com。

（2015-06-27）