心肌細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及β3-AR蛋白提取方法的比較

馬苗苗，胡小芳，朱曉麗，王麗△，馬依彤，楊毅寧，陳邦黨

實(shí)驗(yàn)研究

心肌細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及β3-AR蛋白提取方法的比較

馬苗苗1，胡小芳1，朱曉麗1，王麗1△，馬依彤2，楊毅寧2，陳邦黨2

目的 優(yōu)化培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞的技術(shù)，篩選出簡便、準(zhǔn)確、特異的提取心肌細(xì)胞β3-腎上腺素能受體（β3-AR）膜蛋白的方法。方法 使用Ⅱ型膠原酶和差速貼壁法收集心肌細(xì)胞，分別用總蛋白法、超速離心法、試劑盒法提取心肌細(xì)胞β3-AR膜蛋白；BCA法進(jìn)行蛋白定量；Western blot法檢測蛋白樣品中β3-AR和GAPDH相對含量及提取蛋白的特異性。結(jié)果 優(yōu)化心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法可以使所得細(xì)胞產(chǎn)量大、濃度高，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)。試劑盒法提取蛋白的濃度（8.26±0.29）g/L＞總蛋白法提取法的（5.12±0.47）g/L＞超速離心法的（3.20±0.37）g/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot檢測結(jié)果示，試劑盒提取法所得β3-AR膜蛋白含量（0.22±0.05）＞超速離心法（0.09±0.03）＞總蛋白提取法（0.01±0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 優(yōu)化培養(yǎng)心肌細(xì)胞的方法可獲得高產(chǎn)量、高純度的細(xì)胞。試劑盒提取法可有效提高β3-AR膜蛋白的濃度和特異性。

受體，腎上腺素能β3；肌細(xì)胞，心臟；提取法；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；心肌細(xì)胞；β3-AR膜蛋白

心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)具有保持細(xì)胞特有結(jié)構(gòu)和功能的特點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于心血管等疾病的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域［1］。由于心肌細(xì)胞是終末細(xì)胞，不具備分化及增殖能力，如何成功培養(yǎng)高純度、活力好的心肌細(xì)胞就成為許多研究的前提。近年來的研究表明β3-腎上腺素能受體（β3-adrenergic receptor，β3-AR）對心臟的作用不可忽視［2］。提取β3-AR蛋白是后續(xù)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，所得蛋白純度的高低直接影響下一步蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。Germack等［3-4］使用超速離心法獲得心肌細(xì)胞β3-AR膜蛋白，其具體過程未見詳細(xì)報道。本文選用3種方法提取心肌細(xì)胞β3-AR膜蛋白，應(yīng)用Western blot方法檢測該蛋白的表達(dá)情況，以確定出最佳的方法，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 出生1～3 d的SD乳鼠15只，雌雄不限，購自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心。胎牛血清及牛血清白蛋白（BSA）、高糖培養(yǎng)基（DMEM）購自Gibco公司；雙抗購自HyClone公司；谷氨酰胺、D-Hanks、TritonX-100、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）均購自Sigma公司；Ⅱ型膠原酶購自Worthington公司；正常驢血清、DAPI購自ImmunoReagents公司；小鼠抗心肌肌鈣蛋白T抗體、β3-AR抗體購自Abcam公司；蛋白裂解液、BCA液購自Thermo公司；GAPDH抗體購于Cell Signaling Technology公司；二抗購于Invitrogen公司；膜蛋白提取試劑盒購于Merck公司。

1.2 心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 取新生乳鼠的心臟，剪成0.5 mm3小組織塊，加入1 g/LⅡ型膠原酶和10%BSA溶液，置于37℃搖床中消化分離心肌組織，待組織消化完全后，2次差速貼壁分離出心肌細(xì)胞，加入BrdU抑制非心肌細(xì)胞生長，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)心肌細(xì)胞后，接種于培養(yǎng)皿中。應(yīng)用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。

1.3 心肌細(xì)胞的鑒定 取心肌細(xì)胞3×105/mL接種于蓋玻片的6孔板內(nèi)制作細(xì)胞爬片，48 h后取出爬片，40 g/L多聚甲醛固定15 min，2.5 mL/L Triton X-100透化10 min，驢血清室溫封閉30 min，加入小鼠抗心肌肌鈣蛋白T抗體，室溫孵育1 h，加入熒光二抗，避光室溫孵育1 h，再加入DAPI避光孵育1 min，倒置熒光顯微鏡下拍照。隨機(jī)取10個高倍（×400）視野計(jì)數(shù)紅色胞質(zhì)細(xì)胞數(shù)及藍(lán)色細(xì)胞核數(shù)。心肌細(xì)胞率（%）=紅色胞質(zhì)細(xì)胞數(shù)/藍(lán)色細(xì)胞核數(shù)×100%。

1.4 3種提取β3-AR蛋白的方法

1.4.1 總蛋白提取法 取培養(yǎng)72 h形態(tài)良好的心肌細(xì)胞約2×106，置于冰上，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS清洗3遍，加入500 mL的蛋白裂解液（RIPA∶PMSF按100∶1的比例混合），再分別加入5μL磷酸酶抑制劑和EDTA，冰上裂解5 min后，用細(xì)胞刮齒將細(xì)胞裂解產(chǎn)物刮下，收集至離心管內(nèi)，超聲波處理3 min，然后14 000 r/min，4℃離心15 min，取上清，于-80℃保存。

1.4.2 超速離心提取法 細(xì)胞裂解方法與總蛋白法一致，在4℃離心15 min后，收集上清置于超速離心機(jī)中，100 000 r/ min，4℃離心30 min，沉淀用PBS重懸。加入1%Triton X-100，4℃放置2 h，再次100 000 r/min，4℃離心30 min，收集上清，-80℃保存。

1.4.3 試劑盒提取法 按照 ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用較溫和的Buffer 2A提取。冰上操作，用預(yù)冷的PBS清洗3遍，培養(yǎng)皿中加入3 mL PBS，再用刮齒刮下細(xì)胞，收集到15 mL離心管中，1 000 r/min，4℃離心5 min。棄去上清液并加入Buffer 1和蛋白酶抑制劑，重懸，冰上孵育10 min。1 000 r/min，4℃離心5 min，取下層沉淀加入Buffer 2A和蛋白酶抑制劑，再次重懸，室溫孵育45 min。再次16 000 r/min，4℃離心15 min，收集上清，-80℃保存。

1.5 BCA法對蛋白進(jìn)行定量分析 BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，先將A、B液按50∶1的比例配制成嫩綠色的工作液，用PBS按一定濃度稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)品，待測樣品蛋白稀釋10倍。96孔板中加入反應(yīng)體系，放置37℃恒溫箱30 min，562 nm波長處測得光密度（OD）值，計(jì)算蛋白濃度。

1.6 Western blot檢測 按每孔30 μg上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，脫脂牛奶室溫封膜，0.5%TBST洗膜，加入一抗，4℃過夜。洗完膜后二抗再孵育1 h，用ECL法進(jìn)行顯色，Bio-Rad成像分析系統(tǒng)掃描，Image Lab軟件分析灰度值。以GAPDH作內(nèi)參，目的蛋白與內(nèi)參顯色條帶的灰度比值代表目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞的熒光鑒定 心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，鏡下可見細(xì)胞呈梭形及多邊形，折光性強(qiáng)，有自發(fā)性的搏動，但節(jié)律和強(qiáng)度不同，見圖1。倒置熒光顯微鏡下觀察，部分細(xì)胞可見雙核，細(xì)胞胞漿被抗心肌肌鈣蛋白T（cTnT）抗體特異性染成紅色，DAPI將細(xì)胞核染為藍(lán)色，計(jì)數(shù)后所得心肌細(xì)胞純度達(dá)95%，見圖2。

2.2 BCA法測定提取蛋白濃度結(jié)果 試劑盒提取法所得蛋白的濃度（8.26±0.29）g/L＞總蛋白提取法（5.12±0.47）g/L＞超速離心提取法（3.20±0.37）g/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

2.3 Western blotting檢測結(jié)果 總蛋白提取法只有GAPDH 1條帶，超速離心提取法有多條帶，試劑盒提取法有目的β3-AR膜蛋白和GAPDH 2條帶。試劑盒提取法所得β3-AR膜蛋白含量（0.22±0.05）＞超速離心提取法（0.09±0.03）＞總蛋白提取法（0.01± 0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

Fig.2 Fluorescent identification of cardiomyocytes（×400）圖2 心肌細(xì)胞熒光鑒定（×400）

Fig.3 Protein concentration in the each groups圖3 各組蛋白濃度比較

Fig.4 Level of β3-AR detected by Western blot圖4 Western blot檢測β3-AR膜蛋白表達(dá)

3 討論

自心肌細(xì)胞成功培養(yǎng)以來，人們就不斷完善和改進(jìn)分離、純化的方法，以便獲得更高活力和產(chǎn)量的心肌細(xì)胞［5］。本文借鑒前人的經(jīng)驗(yàn)，對Kim do等［6］的方法進(jìn)行改良，培養(yǎng)出純度較高、活力較強(qiáng)的原代乳鼠心肌細(xì)胞，以滿足科研的要求。

實(shí)驗(yàn)中采用含BSA的Ⅱ型膠原酶，這點(diǎn)不同于其他的研究［7-8］，目的為保證細(xì)胞在消化過程所需營養(yǎng)，降低細(xì)胞的死亡率。消化過程均在37℃條件下完成，只要與細(xì)胞接觸的液體均保持在37℃，以減少外界環(huán)境對細(xì)胞的刺激。通過兩次差速貼壁每次50 min，得到純度較高的心肌細(xì)胞，加入BrdU抑制了非心肌細(xì)胞生長，并用臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)心肌細(xì)胞，去除死細(xì)胞的影響。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞接種密度不宜過低，否則會影響細(xì)胞間交流，不利于細(xì)胞生長。熒光鑒定顯示培養(yǎng)48 h后細(xì)胞狀態(tài)最好，所得細(xì)胞產(chǎn)量大、成活率較高，純度可達(dá)95%，其純度和存活率均能滿足后續(xù)提取膜蛋白的實(shí)驗(yàn)研究要求。

β3-AR為膜受體蛋白，由7個22～28個氨基酸殘基構(gòu)成的疏水跨膜域組成，含3個胞內(nèi)環(huán)和3個胞外環(huán)以及胞內(nèi)的C端和胞外的N端［9］?，F(xiàn)行的膜蛋白提取方法有很多種，如超聲破碎法、反復(fù)凍融法、低滲裂解法、超速離心法等［10］。不同的實(shí)驗(yàn)室根據(jù)所提組織或細(xì)胞及膜蛋白種類不同，采取不同的破膜方法。本實(shí)驗(yàn)的研究對象為原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞，細(xì)胞無法進(jìn)行增殖和傳代，實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞量較大，在獲取細(xì)胞上較為困難。β3-AR膜蛋白在正常的心肌細(xì)胞上表達(dá)量少［11-12］，只有在受到外界刺激，如去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、血管緊張素Ⅱ等誘導(dǎo)作用時其表達(dá)量才有所增高［13］。正是由于β 3-AR復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，在提取時受到諸多條件的限制，所以在獲得蛋白上需要更高的要求。

總蛋白提取法可提取膜蛋白、胞漿蛋白和核蛋白，該方法對疏水性跨膜蛋白提取效率有限，最終獲得的膜蛋白率低。周斌等［14］對豬腎細(xì)胞進(jìn)行膜蛋白提取，發(fā)現(xiàn)超聲提取的總蛋白濃度最高，但此方法破壞了膜的完整性。本實(shí)驗(yàn)中Western blot結(jié)果幾乎檢測不到β3-AR膜蛋白的表達(dá)，很可能是因?yàn)棣?-AR膜蛋白被破壞，或者是其在總蛋白中濃度較小，不易檢測到。

有研究表明，細(xì)胞膜蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在細(xì)胞中存在微觀不均一性，提取過程中易被破壞，其分離純化一直是個難點(diǎn)［15］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超速離心收集到的膜蛋白濃度最低，Western blot結(jié)果出現(xiàn)多條雜帶，這很可能是長時間的高速離心使蛋白丟失和膜結(jié)構(gòu)降解，從而使獲取的蛋白特異性降低。再次，由于超速離心法操作較為復(fù)雜，目前不推薦應(yīng)用于少量細(xì)胞膜蛋白的提取。

本實(shí)驗(yàn)中所用的試劑盒為特殊的7次跨膜蛋白提取試劑盒，按照試劑盒要求使用較溫和的試劑裂解細(xì)胞，最終獲得蛋白濃度較高。Western blot結(jié)果顯示β3-AR膜蛋白特異性較好，無雜帶、拖帶現(xiàn)象，并且操作簡便、快速，不要求過高的設(shè)備和條件，對于沒有超速離心機(jī)的實(shí)驗(yàn)室，試劑盒提取法操作簡單，膜蛋白收獲率較高，是較為理想的膜蛋白提取方法。

［1］McCain ML，Agarwal A，Nesmith HW，et al.Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues［J］.Biomaterials，2014，35（21）:5462-5471.doi:10.1016/j.amjmed.2015.01.001.

［2］Ursino MG，Vasina V，Raschi E，et al.The beta3-adrenoceptor as a therapeutic target:Current perspectives［J］.Pharmacol Res，2009，59 （4）:221-234.doi:10.1016/j.phrs.2009.01.002.

［3］Germack R，Dickenson JM.Induction of beta3-adrenergic receptor functional expression following chronic stimulation with noradrenaline in neonatal rat cardiomyocytes［J］.Pharmacol Exp Ther，2006，316（1）:392-402.doi:10.1124/jpet.105.090597.

［4］Barbier J，Rannou-Bekono F，Marchais J，et al.Effect of training on beta1 beta2 beta3 adrenergic and M2 muscarinic receptors in rat heart［J］.Med Sci Sports Exerc，2004，36（6）:949-954.doi:10.1249/ 01.mss.0000128143.93407.39.

［5］Bursac N，Papadaki M，Cohen RJ，et al.Cardiac muscle tissue engineering:toward an in vitro modelfor electrophysiological studies［J］.Am J Physiol，1999，277（2 Pt 2）:H433-444.

［6］Kim do K，Choi E，Song BW，et al.Differentially regulated functional gene clusters identified in early hypoxic cardiomyocytes［J］.Mol Biol Rep，2012，39（10）:9549-9556.doi:10.1007/s11033-012-1819-1.

［7］Hadad I，Veithen A，Springael JY，et al.Stroma cell-derived factor-1α signaling enhances calcium transients and beating frequency in rat neonatal cardiomyocytes［J/OL］.PLoS One，2013，8（2）:e56007.doi: 10.1371/journal.pone.0056007.

［8］Bian W，Jackman CP，Bursac N.Controlling the structural and functional anisotropy of engineered cardiac tissues［J］.Biofabrication，2014，6（2）:024109.doi:10.1088/1758-5082/6/2/024109.

［9］Ursino MG，Vasina V，Raschi E，et al.The beta3-adrenoceptor as a therapeutic target:current perspectives［J］.Pharmacol Res，2009，59 （4）:221-234.doi:10.1016/j.phrs.2009.01.002.

［10］Massimo DM，Giovanni C，Luca F，et al.Functional involvement of β 3-adrenergicreceptorsinmelanomagrowthandvascularization［J］.JMol Med，2013，91（12）:1407-1419.doi:10.1007/s00109-013-1073-6.

［11］Gauthier C，Tavernier G，Charpentier F，et al.Functional beta3-adrenoceptor in the human heart［J］.J Clin Invest，1996，98（2）:556-562.doi:10.1172/jci118823.

［12］Rozec B，Erfanian M，Laurent K，et al.Nebivolol a vasodilating selective beta（1）-blocker，is a beta（3）-adrenoceptor agonist in the nonfailing transplanted human heart［J］.J Am Coll Cardiol，2009，53: 1532-1538.doi:10.1016/j.jacc.2008.11.057.

［13］Jhaveri DJ，Mackay EW，Hamlin AS，et al.Norepinephrine directly activates adult hippocampal precursors via beta3-adrenergic receptors［J］.J Neurosci，2010，30（7）:2795-2806.doi:10.1523/jneurosci.3780-09.2010.

［14］Zhou B，Liu XD，Wang FJ，et al.Comparison on different extraction protocols of PK-15 cell membrane proteins and identification of cellular receptors for classical swine fever virus［J］.Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2011，43（5）:1-5.［周斌，劉曉東，王鳳鵑，等.PK-15細(xì)胞膜蛋白提取方法的比較及豬瘟病毒膜表面受體的初步鑒定［J］.畜牧與獸醫(yī)，2011，43（5）:1-5］.

［15］Chen JY，Guo BF，He FL，et al.The comparison of protein extraction methods of plant for two-dimensional electrophoresis［J］.JIA，2010，26（2）3:97-100.［陳晶瑜，郭寶峰，何付麗，等.適合雙向電泳的植物全蛋白提取方法比較［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（2）3: 97-100］.

（2014-11-12收稿 2015-01-20修回）

（本文編輯 閆娟）

Cultured cardiomyocytes identificaiton and different methods of extracting β3-AR membrane protein comparison

MA Miaomiao1，HU Xiaofang1，ZHU Xiaoli1，WANG Li1△，MA Yitong2，YANG Yining2，CHEN Bangdang2
1 Department of Cardiology，the First Affiliated Hospital，School of Medicine，Shihezi University，Shihezi 832008，China；
2 Heart Centre，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
△Corresponding AuthorE-mail：mcmwl@163.com

Objective To optimize primary cultures techniques of isolating neonatal rat cardiomyocytes and to compare three different methods of extracting β3-adrenergic receptor（β3-AR）membrane protein from cultured neonatal rat cardiomyocytes.Methods TypeⅡcollagen and differential velocity adhesion were used to collect primary cardiomyocytes.Total protein method，ultracentrifugation method，extract kit method were used to isolate cardiomyocytes β3-AR membrane proteins.The BCA method was applied for protein quantification.Relative content of β3-AR membrane protein and GADPH in the sample were examined by western blot.Results Optimizing culture and isolation skills can produce a great quantity of cardiomyocytes in high concentration.The kit method acquired a higher level of protein concentration（8.26±0.29）g/L than total protein method（5.12±0.47）g/L does than ultracentrifugation method（3.20±0.37）g/L does all of which were with significant difference（P＜0.05）.The concentration of β3-AR membrane protein was higher if obtained by kit method（0.22± 0.05）than ultracentrifugation method（0.09±0.03）than total protein method（0.01±0.01）with significant difference（P＜0.05）.Conclusion optimizing methodology can obtain abundant myocardial cells in high concentraion.The kit method of isolating primary cultured β3-AR membrane proteins result in improved concentration and specificity of membrane protein.

eceptors，adrenergic，beta-3；myocytes，cardiac；extraction；cell culture techniques；cardiomyocytes；β3-AR membrane protein

R331

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.006

國家自然科學(xué)基金-地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（81260028）；石河子大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“自然科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新”團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新項(xiàng)目（2011ZRKXTD-07）

1新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科（郵編832008）；2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心

馬苗苗（1989），女，碩士在讀，主要從事冠心病的臨床與基礎(chǔ)研究

△E-mail：mcmwl@163.com