載納米銀二氧化鈦納米管抑菌能力研究

苗靜雯，張旭，張文怡，孫迎春，馬士卿，高平

載納米銀二氧化鈦納米管抑菌能力研究

苗靜雯，張旭，張文怡，孫迎春，馬士卿，高平△

目的 檢測載納米銀二氧化鈦（TiO2）納米管對于金黃色葡萄球菌的抑菌作用，為種植體局部給藥提供理論基礎。方法 利用陽極氧化法分別在10 V和18 V恒定電壓下制作不同管徑的排列有序的TiO2納米管，將納米銀進行原位置換導入。掃描電鏡以及透射電鏡檢測納米銀、TiO2納米管及載納米銀TiO2納米管的表面形貌，計算納米銀的最小抑菌濃度，于載納米銀TiO2納米管表面培養(yǎng)金黃色葡萄球菌1、3、5 d后，測試對周圍浮游菌的抑菌性，通過掃描電鏡測試抑制細菌的黏附性能。結果 紫外線照射后的載納米銀TiO2納米管形成更加疏水的材料表面，18 V電壓下制備出均勻有序直徑為80～120 nm的TiO2納米管，加載直徑為20 nm納米銀，能有效抑制金黃色葡萄球菌的黏附與增殖。結論 18 V電壓下制作出的TiO2納米管載入濃度為100 mmol/L的納米銀溶液能在3 d內(nèi)有效抑制金黃色葡萄球菌的黏附與增殖，減少種植體周圍炎的發(fā)生。

納米管；鈦；銀；納米結構；微生物敏感性試驗；細菌黏附

種植修復為牙列缺損以及牙列缺失較重要的修復方法，具有咀嚼效力高、舒適感強以及不損傷鄰牙等優(yōu)點，但是在長期的隨訪觀察中仍有2%～3%的失敗率［1］，而種植體周圍炎為造成種植失敗的主要原因。如果進行廣譜抗菌藥物全身給藥容易形成耐藥菌從而導致種植時間延長等不良后果，因此局部給抑菌藥物并且減少耐藥菌的形成成為近期研究重點。本文以二氧化鈦（TiO2）納米管為載體，以納米銀作為抑菌劑改變種植體的表面性能，測試其對金黃色葡萄球菌的抑菌性能，以期為進一步研發(fā)具有良好抑菌性的種植體材料提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料試劑 TA2純鈦（陜西寶雞鈦業(yè)有限公司），氫氟酸（天津市贏達稀貴化學試劑廠），硝酸銀、L-抗壞血酸、LB培養(yǎng)基、PBS、戊二醛（上海生工生物工程有限公司），金黃色葡萄球菌（ATCC6538）。

1.1.2 設備和儀器 DW-P401-40ACEO型高壓直流電源（天津市東文高壓電源廠），SH-2型磁力加熱攪拌器（天津泰斯特儀器有限公司）。NANO SEM 430型掃描電子顯微鏡-X射線光電子能譜分析（美國FEI公司），JC2000D1型接觸角測量儀（廈門邁凱倫精瑞科儀有限公司），JEM-2100F透射電鏡（日本電子株式會社）。

1.2 方法

1.2.1 純鈦試件的處理及載納米銀TiO2納米管的制備 純鈦板在氬氣下切割成直徑15 mm×15 mm×0.5 mm的試件。試件表面分別經(jīng)100目、240目、400目、600目、800目、1 000目、1 200目SiC砂紙打磨后，依次用丙酮、乙醇和蒸餾水超聲清洗10 min，室溫下干燥。利用陽極氧化原理對試件進行處理，未經(jīng)陽極氧化的鈦片標記為光滑鈦。以0.5%HF為電解液，鈦片為陽極，鉑片為陰極制作電解池，分別在10 V和18 V電壓下常溫磁力攪拌陽極氧化1 h，分別標記為10 V TiO2和18 V TiO2。陽極氧化結束后用去離子水沖洗后超聲清洗10 s，室溫干燥。將1、10、100 mmol/L硝酸銀溶液，以0.1%聚乙烯醇（PVA）作為保護劑，在加熱近沸點的條件下，逐滴滴加10 mmol/L抗壞血酸溶液持續(xù)攪拌15 min至逐漸變?yōu)榻瘘S色，繼續(xù)攪拌15 min至溶液穩(wěn)定，制備出濃度分別為1、10、100 mmol/L的納米銀溶液，可在4℃冰箱內(nèi)保持數(shù)月。將制備好的18 V TiO2置入15 mL 1、10、100 mmol/L納米銀溶液中，加入30 mL無水乙醇，超聲震蕩45 min后將納米銀原位置換載入TiO2納米管中，獲得試樣分別標記為18 V-Ag1、18 V-Ag10、18 V-Ag100，將10 V TiO2置入15 mL 100 mmol/L納米銀溶液中，加入30 mL無水乙醇超聲震蕩45 min獲得試樣標記為10 V-Ag100。

1.2.2 測樣表征 場發(fā)射掃描電鏡（field emission scanning electron microscope，F(xiàn)E-SEM）測試光滑鈦，5、18、20 V TiO2納米管的表面形貌，使用透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）測試納米銀形貌以及剝脫制取的載納米銀TiO2的形貌。使用X射線光電子能譜分析（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）測試18 V-Ag100和10 V-Ag100試樣表面成分。使用接觸角測量儀座滴法測量試樣在紫外燈照射前以及照射30 min后的10 V、18 V、光滑鈦、18 V-Ag1、18 V-Ag10、10 V-Ag100、18 V-Ag100蒸餾水在試樣材料表面接觸角。

1.2.3 最小抑菌濃度的測定 在第1列中放入160 μL LB培養(yǎng)基，分別加入100、10、1、0.1 mmol/L納米銀溶液40 μL，其余每行加入100 μL培養(yǎng)基采用二倍稀釋法依次稀釋，將每孔中加入100 μL 1×108CFU金黃色葡萄球菌，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 d后觀察，選取肉眼下渾濁的液體前一濃度至每行第1列依次涂平板，將平板內(nèi)菌落數(shù)小于5個作為抑菌標志，經(jīng)計算得出最小抑菌濃度。

1.2.4 抑菌試驗 將18 V-Ag1、18 V-Ag10、10 V-Ag100、18 V-Ag100作為實驗組，光滑鈦和18 V TiO2作為對照組，紫外光照射30 min后，放入12孔板中，依次加入1 mL 1×105CFU金黃色葡萄球菌菌液，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每24 h對樣品進行漂洗并更換菌液及培養(yǎng)基，培養(yǎng)1、3、5 d后，取培養(yǎng)基進行平板計數(shù)法測試周圍浮游菌的數(shù)目。浮游菌的抗菌性能以及抑菌黏附性能用以下公式計算：種植體周圍浮游細菌抗菌率=（光滑鈦周圍培養(yǎng)基中的細菌數(shù)-試樣周圍培養(yǎng)基的細菌數(shù)）/光滑鈦周圍培養(yǎng)基中的細菌數(shù)。

1.2.5 試樣表面細菌培養(yǎng)掃描電鏡 試樣消毒后如上述步驟每日更換菌液培養(yǎng)，培養(yǎng)1、3 d后用2%戊二醛表面細菌固定，依次用30%、50%、70%、95%乙醇，無水乙醇梯度脫水各15 min，冷凍干燥后噴金掃描電鏡觀測樣品表面形貌。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，2組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同電壓下 TiO2納米管 FE-SEM下的形態(tài) TiO2納米管管徑隨電壓的升高而變大，5 V制作的表面呈凸起柱狀，18 V制作的表面為均勻分布的管狀平面直徑為80～120 nm，20 V制作出的樣品表面凹凸不平不光滑，管壁出現(xiàn)溶解破裂，見圖1。

Fig.1 FE-SEM observation of smooth titanium（×100）and titanium nanotubes（×100 000）圖1 FE-SEM觀察光滑鈦（×100）及鈦納米管（×100 000）

2.2 不同濃度納米銀直徑及載納米銀TiO2納米管形態(tài)及表面元素含量 不同濃度的納米銀直徑均為20 nm，但保護劑內(nèi)的納米銀粒子數(shù)量隨濃度增高而增多，見圖2。剝脫的TiO2內(nèi)有直徑約20 nm的阻射黑色點狀物，考慮為納米銀顆粒，見圖3。掃描電鏡下樣品表面有顆粒狀物質，為納米銀沉積，見圖4。表面能譜分析表明有銀離子波峰存在，波峰高低指示銀元素在材料表面含量多少，見圖5、6。

2.3 接觸角測試 載納米銀的TiO2納米管紫外線照射30 min后接觸角均有不同程度的減小，形成更加親水的表面涂層，而未載納米銀TiO2納米管紫外線照射30 min后接觸角上升，形成疏水表面。紫外線照射前后樣本接觸角差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

Fig.2 TEM observation of concentrations of nanosilver solution圖2 TEM觀測不同濃度納米銀溶液（×20 000）

Fig.3 TEM detection of peeling silver nanoparticals loaded titanium nanotubes圖3 TEM測試剝脫載納米銀TiO2納米管（×15 000）

Fig.4 The surface morphology of silver nanoparticals loaded titanium nanotubes detected by FE-SEM圖4 FE-SEM測試載納米銀TiO2納米管表面形貌

Fig.5 The surface 10V-Ag100 content detected by XPS testing圖5 XPS測試10V-Ag100表面元素含量

Fig.6 The surface18V-Ag100 content detected by XPS testing圖6 XPS測試18V-Ag100表面元素含量

Tab.1 Comparison of contact angles before and after ultraviolet irradiation表1 紫外線照射前后接觸角比較（n=6，°，x±s）

2.4 抑菌能力測定 經(jīng)計算測得最小抑菌濃度為0.125～0.156 mmol/L。培養(yǎng)后平板計數(shù)法測出周圍浮游菌菌落數(shù)目，光滑鈦和紫外線照射后的TiO2納米管組細菌菌落鋪滿平板，無法計數(shù)，與細菌原菌液涂平板效果相仿，基本無抑菌性，種植體周圍浮游細菌抗菌率為零。載納米銀的TiO2在第1天均有較好的抑菌性，10 V-Ag100與18 V-Ag100抑菌率達100%，18 V-Ag1、18 V-Ag10平板計數(shù)有個別細菌存在，抑菌率分別為（99.59±0.085）%和（99.93± 0.058）%。第3天只有18 V-Ag100有較好的抑菌性（96.33±1.19）%，10 V-Ag100也有一定的抑菌性（84.44±1.93）%，但有少數(shù)細菌鋪展。在第5天各組均不能有效抑菌。樣品表面細菌培養(yǎng)第1天18 VAg100和10 V-Ag100基本無細菌黏附，且載納米銀的樣品細菌黏附明顯小于未載藥18 V TiO2及光滑鈦，見圖7。培養(yǎng)3 d后各組黏附細菌均高于第1天，18 V-Ag100較少細菌黏附，10 V-Ag100略有細菌黏附，數(shù)目明顯小于其余各試樣，見圖8。

3 討論

在種植體植入最初6 h［2］為細菌與細胞競爭種植體表面的決定性時間［3］，當細菌優(yōu)先吸附于種植體表面時會形成生物膜，從而保護細菌不被宿主防御系統(tǒng)以及抗菌藥物清除［4］，形成種植體周圍的慢性炎癥，目前最常見的抗炎方式是服用廣譜抗菌藥物，不僅到達靶位置的藥物濃度很低，而且長期使用抗菌藥物還會造成機體內(nèi)耐藥菌的形成［5］。因此在種植后短期內(nèi)抑制種植體周圍細菌黏附種植體表面以及局部給予抑菌藥物成為研究熱點。TiO2納米管由于其高度有序的表面形貌能夠促進成骨細胞的增殖與分化［6-7］，并可以作為良好的局部給藥的載體［8-9］，抑制種植體周圍炎的形成。銀作為一種廣譜抑菌藥物常被應用于種植體周圍炎局部給藥，其抑菌作用通常是依靠銀離子的釋放進入細菌內(nèi)與細菌體中酶蛋白的巰基結合來完成。以往的制備銀涂層主要是應用物理吸附法、電噴涂及濺射沉積法［10-12］，但這些方法具有載銀粒子尺寸較大，且與納米管結合不佳等缺點，本實驗采用納米銀原位置換的方法將體積較小的納米銀粒子導入納米管中。不但方法更加簡便，而且納米銀依靠其特有的物理及化學性能，較高的體積比等優(yōu)點，不僅擁有更強的抑制細菌甚至抗病毒的性能［13-14］，而且細胞毒性較?。?5］。

本實驗研究結果表明納米管的管徑隨著陽極氧化的電壓升高而增大，18 V制作出的管徑為80～120 nm的高度有序排列的TiO2納米管，納米銀的直徑約為20 nm，在剝脫的載納米銀TiO2納米管TEM圖像中可見直徑約20 nm的阻射高密度影，可以考慮納米銀已成功原位載入TiO2納米管中。表面能譜分析相同數(shù)目納米銀原位置換載入后，18 V TiO2表面的銀含量低于10 V TiO2表面，慮為納米銀導入納米管中而不單是吸附于表面，使其表面有更少的銀含量，對于組織具有更小的細胞毒性。紫外線消毒滅菌后載納米銀TiO2能夠有更小的接觸角，證明形成更加親水的表面。Lim等［16］實驗研究證明親水表面有利于成骨細胞的黏附、增殖、分化，還有實驗研究證實經(jīng)過紫外線照射滅菌后的有序的TiO2納米管能夠抑制變形鏈球菌的黏附［17］。

金黃色葡萄球菌為常見的引起種植體周圍炎的細菌［18］。18 V-Ag100樣品在第1天有效抑制金黃色葡萄球菌生長，至第3天仍有良好的抑菌的作用，周圍浮游細菌抑菌率＞95%。FE-SEM顯示18 VAg100樣品抑制細菌黏附的能力明顯高于10 VAg100，證明18 V-Ag100能在種植體植入后最初6 h即細胞細菌競爭種植體表面的關鍵時刻釋放納米銀抑制細菌的黏附，且3 d內(nèi)持續(xù)抑菌，抑菌能力強于10 V-Ag100。為制作種植體周圍炎發(fā)生率低的種植體材料提供理論依據(jù)。

（圖7、8見插頁）

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（2014-06-27收稿 2014-12-27修回）

（本文編輯 魏杰）

Study on antibacterial ability of silver nanoparticles loaded titanium nanotubes

MIAO Jingwen，ZHANG Xu，ZHANG Wenyi，SUN Yingchun，MA Shiqing，GAO Ping△
Stomatological Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China
△Corresponding Author E-mail:gptj@sina.com

Objective To detect the inhibitory effect of siliver nanoparticles loaded titanium nanotubes on staphylococcus aureus，and provide a theoretical basis for implant local application.Methods Orderly arrangement of titania nanotubes produced by anodic oxidation，loaded silver nanoparticals by situ replacement.Scanning electron microscopy（SEM）and transmission electron microscopy（TEM）were used to detect the morphology topology of silver nanoparticals，titanium nanotubes and siliver particals loaded titanium nanotubes.The minimum inhibitory concentration of silver nanoparticles was calculated.The antibacterial of planktonic bacteria was detected 1 day，3 days and 5 days after culturing staphylococcus aureus on siliver particals loaded titanium nanotubes.The inhibitory bacterial adhesion properties were detected by scanning electron microscopy.Results The uniform and orderly diameter of 80～120 nm TiO2 nanotubes were prepared under 18 V voltage，loaded diameter of 20 nm silver nanoparticals，which effectively inhibited adhesion and proliferation of staphylococcus aureus.Conclusion Titanium nanotubes produced by 18 V have a stronger drug loading capacity.The 100 mmol/L silver nanopartical solution loaded nanotubes can effectively inhibit staphylococcus aureus adhesion and proliferation within three days.

nanotubes；titanium；silver；nanostructures；microbial sensitivity tests；bacterial adhesion

R783.1

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.020

國家科技支撐項目基金（2012BAI07B00）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃項目（14JCYBJC29600）；天津市應用基礎及前沿技術研究計劃青年項目（12JCQNJC09200）；全國大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃訓練項目（201310062005）

天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院（郵編300070）

苗靜雯（1989），女，碩士在讀，主要從事種植體材料表面改性研究

△E-mail:gptj@sina.com