干擾素-γ對黑色素瘤細(xì)胞血管生成擬態(tài)的影響及機制

韓健，孫保存△，馬躍美，趙秀蘭

干擾素-γ對黑色素瘤細(xì)胞血管生成擬態(tài)的影響及機制

韓健1，孫保存1△，馬躍美2，趙秀蘭1

目的 研究干擾素-γ（IFN-γ）對人黑色素瘤細(xì)胞系MUM-2B遷移、侵襲和血管生成擬態(tài)（VM）形成能力的影響。方法 將MUM-2B細(xì)胞體外培養(yǎng)后分為3組：對照組在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；實驗1組另加入10 μg/L IFN-γ；實驗2組另加入100 μg/L IFN-γ。利用劃痕實驗和侵襲實驗分析IFN-γ對MUM-2B細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響，三維培養(yǎng)觀察IFN-γ對MUM-2B細(xì)胞VM形成能力的影響，Western blot檢測MUM-2B細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)的變化。結(jié)果 劃痕實驗示實驗組細(xì)胞遷移距離低于對照組，實驗2組低于實驗1組（P＜0.05）；侵襲實驗示實驗組細(xì)胞侵襲數(shù)量低于對照組，實驗2組低于實驗1組（P＜0.05）；三維培養(yǎng)示對照組細(xì)胞能夠形成VM管道結(jié)構(gòu)，實驗組細(xì)胞不能形成明顯的VM管道結(jié)構(gòu)；Western blot示實驗組細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)量低于對照組，實驗2組低于實驗1組（P＜0.05）。結(jié)論 IFN-γ可以在體外抑制MUM-2B細(xì)胞的遷移和侵襲，并通過抑制VEGF的表達(dá)而抑制其VM的形成。

黑色素瘤；干擾素γ，重組；血管內(nèi)皮生長因子類；腫瘤干細(xì)胞；血管生成擬態(tài)

黑色素瘤是侵襲性最強的皮膚腫瘤［1］，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的預(yù)后很差，平均生存期只有4～6個月［2］。腫瘤血管生成是腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的重要條件。與傳統(tǒng)的內(nèi)皮依賴性血管不同，血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）是由腫瘤細(xì)胞通過自身塑形構(gòu)成的一種功能性微循環(huán)管道，可以為腫瘤組織輸送血液和營養(yǎng)物質(zhì)，并有利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［3］。由于VM的存在，單純針對內(nèi)皮細(xì)胞的抗血管生成治療效果往往不理想［4-5］，這提示在抗腫瘤血管生成治療中需要同時兼顧內(nèi)皮依賴性血管與VM才有可能獲得良好的療效。研究顯示干擾素-γ（interferongamma，IFN-γ）能夠抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［6］，但其對腫瘤VM形成是否有影響尚不明確。本文旨在研究IFN-γ在體外對人黑色素瘤MUM-2B細(xì)胞VM形成能力的影響，探討其可能的作用機制，為腫瘤抗血管生成治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人黑色素瘤細(xì)胞系MUM-2B保存于天津醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)實驗室；重組人IFN-γ購于Peprotech公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購于Hyclone公司；Matrigel基質(zhì)購自BD公司；兔抗人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體、兔抗人β-actin抗體購于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組 MUM-2B細(xì)胞接種于含10%FBS、1%雙抗（100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合至90%時傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。將細(xì)胞分為3組：對照組在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；實驗1組在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中加入10 μg/L IFN-γ；實驗2組在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中加入100 μg/L IFN-γ。

1.2.2 細(xì)胞劃痕實驗 將3組MUM-2B細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞生長融合至90%后，棄掉培養(yǎng)基，在細(xì)胞表面進(jìn)行劃痕，PBS清洗游離細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，以此時間點記為0 h。選取任意5個視野，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞從劃痕邊緣向劃痕中央遷移的距離，分別于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h拍照測量細(xì)胞遷移距離。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 Transwell細(xì)胞侵襲實驗 將Matrigel膠以1.5 g/L的終濃度加入上層濾過小室（8 μm直徑小孔）表面；無血清培養(yǎng)液溶解的200 μL細(xì)胞懸液（5×105個/mL）加入上層小室，300 μL含20%FBS的培養(yǎng)基加入下層小室。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，透膜細(xì)胞用冷甲醛固定并用0.5%的結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡觀察并計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 三維培養(yǎng) 將4℃預(yù)處理的Matrigel膠與DMEM培養(yǎng)基1∶1混勻后加入96孔板中，50 μL/孔（冰上操作）；將96孔板置于37℃溫箱中，待膠凝固后，將3組MUM-2B細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個/mL，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。定時于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形成VM管道結(jié)構(gòu)的能力。

1.2.5 Western blot檢測 實驗1組和實驗2組加入不同濃度IFN-γ處理24 h后，與對照組同時裂解細(xì)胞，提取總蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉抗原，加入一抗VEGF（1∶200）、β-actin （1∶1 000），4℃搖床過夜。次日取出PVDF膜，TBST漂洗3遍，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST漂洗3遍?；瘜W(xué)發(fā)光法（ECL）顯影、定影并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，3組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IFN-γ對MUM-2B細(xì)胞遷移能力的影響 對細(xì)胞進(jìn)行劃痕后的0～12 h，3組細(xì)胞遷移距離差異無統(tǒng)計學(xué)意義，24 h后，實驗1組和實驗2組細(xì)胞遷移距離均低于對照組，實驗2組細(xì)胞遷移距離低于實驗1組（F=1 756.524，P＜0.05），見圖1、2。

Fig.1 Migration distances of cells in three groups圖1 3組細(xì)胞遷移距離（×40）

Fig.2 Comparison of migration distances of cells at different time points between three groups圖2 不同時間點3組細(xì)胞遷移距離比較

2.2 IFN-γ對MUM-2B細(xì)胞侵襲能力的影響 加入IFN-γ 24 h后，實驗1組和實驗2組細(xì)胞侵襲數(shù)量均低于對照組，實驗2組低于實驗1組（P＜0.05），見圖3、4。

2.3 IFN-γ對MUM-2B細(xì)胞體外VM管道形成能力的影響 三維培養(yǎng)24 h后，對照組MUM-2B細(xì)胞可形成管腔平滑、結(jié)構(gòu)完整的管道樣結(jié)構(gòu)，實驗1組和實驗2組細(xì)胞均不能形成明顯的管道樣結(jié)構(gòu)，見圖5；且隨著濃度的增加，IFN-γ對MUM-2B細(xì)胞管道形成的抑制作用增強。

Fig.4 Comparison of invaded cell numbers between three groups圖4 3組24后細(xì)胞侵襲數(shù)量比較

2.4 IFN-γ對MUM-2B細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)水平的影響 加入IFN-γ 24 h后，實驗1組和實驗2組的細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)量均低于對照組，實驗2組低于實驗1組（P＜0.05），見圖6、7。

Fig.6 VEGF protein expressions of cells in three groups圖6 3組24 h后細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)水平

Fig.7 Comparison of VEGF protein expressions of cells between three groups圖7 3組24 h后細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是一個依賴于血管生成的過程。Maniotis等［7］在研究高侵襲性人眼葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)時發(fā)現(xiàn)并提出了一種全新的腫瘤血管生成模式，即VM，這種模式下惡性腫瘤細(xì)胞可以通過自身塑形和基質(zhì)重塑而形成一種無內(nèi)皮細(xì)胞襯覆、僅僅由腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的微循環(huán)管道，血液可在其中流動。研究顯示VM能夠為腫瘤組織提供氧分和營養(yǎng)物質(zhì)，其與內(nèi)皮依賴性血管之間的連接可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血道播散，因此，VM的存在預(yù)示著腫瘤具有更高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，以及更差的預(yù)后［3］。腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）是腫瘤組織中具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群［8］。能夠形成VM的高侵襲性黑色素瘤細(xì)胞高表達(dá)與干細(xì)胞相關(guān)的基因，當(dāng)新生血管的血液供應(yīng)不足以滿足腫瘤的生長需要時，CD133表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞可以模擬內(nèi)皮細(xì)胞的功能并參與VM形成，提示CSCs可以向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化，在腫瘤VM的形成中起重要作用，針對CSCs的靶向治療可以抑制腫瘤細(xì)胞VM的形成［9-10］。

IFN-γ是多功能細(xì)胞因子家族的成員，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤特性［11］。研究報道IFN-γ可以抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，將IFN-γ基因轉(zhuǎn)入小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B-16后，可有效抑制B-16細(xì)胞的生長［6，12］。本研究顯示IFN-γ能夠在體外抑制人黑色素瘤細(xì)胞系MUM-2B的侵襲和遷移能力，與既往報道相符［6］，且抑制作用隨著IFN-γ濃度的增加而增強，呈劑量依賴性。本研究通過三維培養(yǎng)進(jìn)一步觀察IFN-γ在體外對MUM-2B細(xì)胞VM管道形成能力的影響，結(jié)果顯示IFN-γ能夠抑制MUM-2B細(xì)胞的管道形成能力，并呈劑量依賴性。上述結(jié)果提示100 μg/L的IFN-γ對MUM-2B細(xì)胞的侵襲、遷移和VM管道形成能力的抑制作用更強。有研究報道IFN-γ能夠通過激活吲哚胺2，3-加雙氧酶（IDO）而抑制間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，并可誘導(dǎo)或增強間充質(zhì)干細(xì)胞抑制因子的產(chǎn)生［13-14］，因此推測IFN-γ對MUM-2B細(xì)胞VM的抑制作用是通過對CSCs的影響而實現(xiàn)的。

VEGF不僅是重要的血管生成因子，還可以促進(jìn)CSCs向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。研究報道VEGF可以通過VEGFR-2/STAT3通路促進(jìn)CSCs的自我更新，并能通過激活PI3K/Akt通路在體外促進(jìn)大鼠干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化，抑制VEGF的表達(dá)后，C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖和侵襲能力下降［15-17］，提示VEGF對CSCs的生長和分化具有促進(jìn)作用，抑制VEGF的表達(dá)可以抑制CSCs向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。本研究通過Western blot檢測了IFN-γ對MUM-2B細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響，結(jié)果顯示IFN-γ能夠在蛋白水平抑制MUM-2B細(xì)胞VEGF的表達(dá)，并呈劑量依賴性，與其對MUM-2B細(xì)胞VM管道形成能力的抑制作用相一致，提示IFN-γ可能通過抑制VEGF的表達(dá)從而抑制了MUM-2B細(xì)胞中CSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向的分化，最終抑制了VM的形成。

綜上，IFN-γ可以在體外抑制人黑色素瘤MUM-2B細(xì)胞VM的形成，其機制可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)進(jìn)而抑制CSCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化而實現(xiàn)的，提示IFN-γ可以作為潛在的抑制劑對VM這一腫瘤生長早期血液供應(yīng)的主要來源進(jìn)行干預(yù)，為腫瘤的臨床治療提供了新的思路。

（圖3、5見插頁）

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（2014-12-10收稿 2015-01-25修回）

（本文編輯 閆娟）

Effects and mechanism of interferon-gamma on vasculogenic mimicry of melanoma cells

HAN Jian1，SUN Baocun1△，MA Yuemei2，ZHAO Xiulan1
1 Department of Pathology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Surgery，Tianjin Medical University
△Corresponding Author E-mail:sunbaocun@aliyun.com

Objective To investigate the effects of interferon-gamma（IFN-γ）on migration，invasion and vasculogenic mimicry（VM）formation of human melanoma cell line MUM-2B.Methods MUM-2B cells were divided into three groups，control group（10%FBS in DMEM），treatment group1（10 μg/L IFN-γ）and treatment group2（100 μg/L IFN-γ）.Different concentrations of IFN-γ were added in the culture medium of MUM-2B cells.Wound-healing assay and matrigel invasion assay were performed to examine the migration and invasion ability of MUM-2B cells.Three-D culture was used to observe the VM formation.The expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）of MUM-2B cells was detected by Western blot assay.Results The result of wound-healing assay showed that the migration distance of cells was decreased in treatment groups compared with that of control group.The migration distance of cells was decreased in treatment group2 compared with that of treatment group 1（P＜0.05）.The result of matrigel invasion assay showed that the number of invaded cells was decreased in treatment groups compared with that of control group，and which was significantly decreased in treatment group2 than that of treatment group1（P＜0.05）.The result of 3-D culture showed that cells in control group can form typical VM tube-like structures，whereas cells in treatment groups cannot.Western blot assay showed that the expression of VEGF protein was significantly decreased in treatment groups compared with that of control group，and the expression of VEGF protein was significantly decreased in treatment group2 than that of treatment group 1（P＜0.05）.Conclusion These data suggest that IFN-γ inhibits migration and invasion of MUM-2B cells，and inhibits VM formation by down regulating VEGF expression in vitro.

melanoma；interferon-gamma，recombinant；vascular endothelial growth factors；cancer stem cells；vasculogenic mimicry

R739.5

A DOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.05.002

國家自然科學(xué)基金重點項目（81230050）；天津市科委重點項目（10JCZDJC20400）

1天津醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室（郵編300070）；2天津醫(yī)科大學(xué)外科手術(shù)學(xué)教研室

韓?。?983），男，助理實驗師，碩士在讀，主要從事腫瘤病理學(xué)研究

△E-mail：sunbaocun@aliyun.com