HIF-1α及靶基因在糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合過程中基因表達(dá)的研究及意義

景麗峰， 李 勤， 李 爽

HIF-1α及靶基因在糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合過程中基因表達(dá)的研究及意義

景麗峰， 李 勤， 李 爽

目的 通過研究BALB/c糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合過程中HIF-1α、VEGF、SDF-1a和CXCR4在不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)情況，從血管生成的調(diào)控方面探討糖尿病創(chuàng)面難愈的機(jī)制。方法 建立糖尿病小鼠模型后4周，建立小鼠背部皮膚正中近頸側(cè)直徑約6 mm的圓形皮膚全層缺損模型，分別于傷后即刻，3、7、10 d獲取創(chuàng)面組織，計(jì)算創(chuàng)面的愈合率，檢測(cè)損傷后各時(shí)間點(diǎn)HIF-1α、VEGF、SDF-1a和CXCR4的基因相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 糖尿病組小鼠的創(chuàng)面愈合率第3、7、10天，分別為(7.0±5.8)%、(38.7±6.0)%、(80.0±3.0)%，明顯小于對(duì)照組；創(chuàng)傷前糖尿病組小鼠皮膚中的目的基因表達(dá)量低于對(duì)照組；創(chuàng)傷后對(duì)照組和糖尿病組小鼠皮膚中目的基因表達(dá)量較創(chuàng)傷前明顯增加，于第3或7天時(shí)表達(dá)量達(dá)高峰，但糖尿病組小鼠的表達(dá)量總體低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 糖尿病組小鼠創(chuàng)面愈合過程中，HIF-1α、VEGF、SDF-1a和CXCR4的基因表達(dá)水平降低，導(dǎo)致血管形成不足，可能是糖尿病創(chuàng)面愈合延遲的原因之一。

糖尿病創(chuàng)面；HIF-1α；VEGF；SDF-1α；CXCR4；

缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1 α, HIF-1α)作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，參與機(jī)體能量代謝、血管生成、細(xì)胞增殖和遷移、細(xì)胞凋亡等病理生理過程，在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮了重要作用[1-2]。自2013年4月至2013年12月，我們以BALB/c正常小鼠創(chuàng)面與糖尿病創(chuàng)面為研究對(duì)象，觀察不同時(shí)段創(chuàng)面和創(chuàng)緣組織中HIF-1α、VEGF、基質(zhì)細(xì)胞衍生生長因子-1(stromal cell derived growth factor-1，SDF-1α)、CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)基因水平的變化，從血管生成的調(diào)控方面探討糖尿病創(chuàng)面難愈的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠50只，6周齡，SPF級(jí)，雌雄比例1∶1，體質(zhì)量(20±2) g，由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物房燈光12 h照明，通風(fēng)和空調(diào)設(shè)備良好，室溫控制在(24±2) ℃，相對(duì)濕度為40%～50%。動(dòng)物飼養(yǎng)1周后，開始造模實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室按常規(guī)定期消毒。實(shí)驗(yàn)過程對(duì)動(dòng)物的操作符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 STZ(美國SIGMA公司)， Tripure(中國聚研公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR GreenⅠ熒光染料(美國ROCHE公司)，HIF-1 alpha Ab(美國GENE TEX公司)，VEGF Ab(美國MILLIPORE公司)， SDF1 Ab(美國CST公司)， CXCR4 Ab(美國MILLIPORE公司)，β-actin Ab(美國EARTH OX公司)， Rabbit IgG HRP Ab(美國CST公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、電泳儀及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(德國BIORAD公司)。

2 實(shí)驗(yàn)過程

2.1 建立糖尿病模型 BALB/c小鼠50只隨機(jī)分為對(duì)照組和糖尿病組各25只，禁食14～16 h，每天腹腔注射1%STZ(40 mg/kg， 糖尿病組)及等體積檸檬酸緩沖液(對(duì)照組0.1 mmol/L，pH 4.4)，連續(xù)注射5 d，所有小鼠注射后均采取自由飲食飲水。注射STZ 1周后斷尾采血，隨機(jī)血糖水平≥16.7 mmol/L即為造模成功， 待模型穩(wěn)定后(1個(gè)月)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[3-4]。

2.2 標(biāo)本采取 腹腔注射麻醉后，于小鼠背部近頸側(cè)以脊柱為中線，用打孔器切取直徑約6 mm 的圓形全層皮膚；創(chuàng)面不用任何藥物，常規(guī)單獨(dú)飼養(yǎng)，分別于創(chuàng)傷后即刻，3、7、10 d，切取兩組小鼠的創(chuàng)面及創(chuàng)緣全層皮膚組織，用液氮凍存，進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)。

2.3 計(jì)算創(chuàng)面愈合率 記錄兩組小鼠創(chuàng)傷后即刻、3、7、10 d時(shí)創(chuàng)面面積。采用兩種方法：①用數(shù)碼相機(jī)按設(shè)置的統(tǒng)一參數(shù)，直接拍攝小鼠創(chuàng)面區(qū)域(含有標(biāo)尺)。將圖片中的創(chuàng)面部分，使用IPP(Image-Pro Plus)圖像處理軟件測(cè)量其面積。②使用薄膜手套覆蓋創(chuàng)面，描記其大小，同樣的方法測(cè)量面積。計(jì)算各組創(chuàng)面愈合率：

2.4 引物設(shè)計(jì) 基因序列采用NCBI自行設(shè)計(jì)，同時(shí)經(jīng)NCBI BLAST 檢索，無顯著同源性。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，具體引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度見表1。

2.5 熒光定量PCR檢測(cè)目的基因表達(dá) 取小鼠皮膚組織，按TriPure試劑說明書分離總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，A260/280比值判定純度。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 后，再進(jìn)行特定引物PCR擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增采用20 μl 反應(yīng)體系：滅菌蒸餾水7 μl，2×SYBR Green I Master 10 μl，10 μM上、下游引物各0.6 μl，DNA 模板2 μl，輕輕混勻后稍微離心。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)的收集由Rotor-gene 6000定量PCR儀自帶軟件完成。目的基因的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式：

△Ct=Ct目的基因-Ct管家基因

注：△Ct高表示基因表達(dá)量低

2.6 Western Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá) 按照Western及IP細(xì)胞裂解液說明書(P0013)，提取各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面及創(chuàng)緣組織的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。然后電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min，3次；二抗室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜10 min，3次；ECL顯色后化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。以Quantity One 圖像分析軟件掃描計(jì)算灰度值。

表1 基因序列及基因序列數(shù)據(jù)

3 結(jié)果

3.1 一般情況 建立糖尿病模型后，糖尿病組小鼠血糖升高，飲食量、尿量明顯增多，體重逐漸下降。對(duì)照組小鼠血糖正常，飲食、大小便等在給藥前后，均未見明顯差別，體質(zhì)量逐漸增加。

3.2 創(chuàng)面愈合率 在創(chuàng)傷愈合過程中，糖尿病小鼠的創(chuàng)面愈合延遲，創(chuàng)面愈合率于3、7、10 d時(shí)分別為(7.0±5.8)%、(38.7±6.0)%、(80.0±3.0)%，明顯小于對(duì)照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 小鼠皮膚創(chuàng)傷后創(chuàng)面愈合率

注：*與對(duì)照組相比，P<0.05

3.3 小鼠皮膚中HIF-1α等基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的變化 創(chuàng)傷前糖尿病小鼠皮膚中HIF-1α、VEGF、SDF-1、CXCR4mRNA表達(dá)量低于對(duì)照組；創(chuàng)傷后對(duì)照組和糖尿病組小鼠皮膚中HIF-1α、VEGF、SDF-1、CXCR4mRNA表達(dá)量，較創(chuàng)傷前明顯增加，于3d或7d時(shí)表達(dá)量達(dá)高峰，但糖尿病小鼠的表達(dá)量總體低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

3.4 小鼠皮膚中HIF-1α等目的蛋白表達(dá)水平 通過WesternBlot檢測(cè)糖尿病小鼠皮膚中HIF-1α，表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。創(chuàng)傷后3、7d，所有目的基因的蛋白水平表達(dá)低于對(duì)照組；10d時(shí)，VEGF、SDF-1andCXCR4蛋白水平表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。創(chuàng)傷后對(duì)照組和糖尿病組小鼠的各種目的蛋白表達(dá)量，較創(chuàng)傷前明顯增加，基本上是3、7d時(shí)表達(dá)量達(dá)高峰，隨之降至創(chuàng)傷前水平。

4 討論

在血管的發(fā)育過程中，HIF1對(duì)血管新生起著至關(guān)重要的作用。HIF1是一個(gè)異二聚體復(fù)合物，由HIF1a和HIF1β亞基構(gòu)成[5]。HIF1a決定了HIF1 的活性，在正常氧濃度條件下，HIF1a被脯氨酸羥化酶羥化后降解；在缺氧條件下，HIF1a通過核定位信號(hào)介導(dǎo)入細(xì)胞核，激活下游基因表達(dá)，對(duì)機(jī)體內(nèi)的一系列因素進(jìn)行調(diào)節(jié)，涉及適應(yīng)和生存機(jī)制[6]。HIF-1調(diào)控的生成血管的生長因子和細(xì)胞因子眾多，包括血管生成素、VEGF、SDF-1、CXCR4和血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等[4]。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠皮膚中HIF-1α及靶基因的表達(dá)水平降低，創(chuàng)面愈合延遲。這是因?yàn)檫^高的葡萄糖濃度會(huì)導(dǎo)致超氧化物增加，進(jìn)一步誘導(dǎo)丙酮醛在細(xì)胞中積累，導(dǎo)致HIF-1α聚泛素化和降解，最終降低HIF-1α蛋白水平；丙酮醛可以阻礙HIF-1α/p300轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成，從而降低HIF-1 的轉(zhuǎn)錄活性[7]。糖尿病創(chuàng)面中HIF-1減少，導(dǎo)致眾多下游靶基因的表達(dá)減少或功能減退，造成血管密度下降，血液循環(huán)不良和傷口愈合障礙，這在糖尿病動(dòng)物模型以及Ⅰ、Ⅱ型糖尿病患者的臨床試驗(yàn)中也被證實(shí)[8]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠皮膚創(chuàng)傷后正常創(chuàng)面和糖尿病創(chuàng)面中HIF-1a的表達(dá)量增加，繼而VEGF等靶基因的表達(dá)量也增加，總體上于3、7 d表達(dá)量達(dá)高峰。創(chuàng)傷后局部低氧微環(huán)境可通過PI3K/Akt信號(hào)通道激活核因子κB，其亞基可結(jié)合HIF-1α啟動(dòng)子，導(dǎo)致HIF-1α mRNA表達(dá)增加[9]。在PKC和PI3K/AKT信號(hào)通路中使用化學(xué)抑制劑的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：這兩個(gè)信號(hào)會(huì)相互促進(jìn)，參與保護(hù)HIF-1α以免pVHL降解，導(dǎo)致HIF1α表達(dá)增加[10]。HIF-1α以及靶基因表達(dá)量總體上于3、7 d時(shí)表達(dá)明顯增加，表明HIF-1及靶基因的表達(dá)與創(chuàng)面愈合的增殖期關(guān)系密切。這可能是因?yàn)閯?chuàng)傷后3～7 d屬于創(chuàng)面愈合的增殖期，此期以創(chuàng)面肉芽組織形成為特征，并逐漸上皮化，新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞都是 VEGF、SDF-1的重要來源[11]。另外，我們認(rèn)為創(chuàng)傷初期低氧環(huán)境激活了Akt/HIF-1/靶基因信號(hào)途徑，隨著低氧環(huán)境逐漸改善，HIF-1α降解增加，HIF-1及靶基因的表達(dá)隨之減少。馮帥南和Liu等[12-13]也發(fā)現(xiàn),創(chuàng)傷后HIF-1α、VEGF、SDF-1α表達(dá)升高，4、7 d時(shí)達(dá)到高峰。

綜上所述，糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合過程中，HIF-1α、VEGF、SDF-1α及CXCR4的總體表達(dá)水平降低，導(dǎo)致血管形成不足，可能是糖尿病創(chuàng)面愈合延遲的原因之一。HIF-1基因治療慢性肢體缺血的研究，已進(jìn)展到臨床Ⅰ期藥物劑量測(cè)試性實(shí)驗(yàn) ，因此，隨著對(duì)HIF-1更加深入地研究，會(huì)有療效良好的HIF-1調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于臨床，促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面的愈合。

時(shí)間HIF-1α對(duì)照組糖尿病組VEGF對(duì)照組糖尿病組SDF-1α對(duì)照組糖尿病組CXCR4對(duì)照組糖尿病組即刻5.68±0.177.19±0.70*6.90±0.237.50±0.29*5.78±0.297.50±0.11*6.6±1.538.39±0.50*3d4.60±0.12△5.36±0.25*△5.10±1.30△6.10±0.04*△5.36±0.506.12±1.15*△6.04±0.976.21±0.42△7d3.85±1.90△5.25±0.16*△4.65±1.17△5.30±0.66*△4.34±0.32△5.51±0.62△4.82±0.86△5.93±1.20*△10d5.50±0.416.20±0.58△6.63±0.796.89±0.816.41±1.28△6.87±1.03*7.08±0.997.12±0.93

注：*與對(duì)照組比較P<0.05；△與傷后即刻比較P<0.05

[1]SenCK.Woundhealingessentials:lettherebeoxygen[J].WoundRepairRegen, 2009,17(1):1-18.

[2]BotusanIR,SunkariVG,SavuO,etal.StabilizationofHIF-1iscriticaltoimprovewoundhealingindiabeticmice[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2008,105(49):19426-19431.

[3]SrinivasanK,ViswanadB,AsratL,etal.Combinationofhigh-fatdiet-fedandlow-dosestreptozotocin-treatedrat:amodelfortype2diabetesandpharmacologicalscreening[J].PharmacolRes, 2005,52(4):313-320.

[4]SemenzaGL.HIF-1:mediatorofphysiologicalandpathophysiologicalresponsestohypoxia[J].JApplPhysiol, 2000,88(4):1474-1480.

[5]AndrikopoulouE,ZhangX,SebastianR,etal.CurrentInsightsintotheRoleofHIF-1inCutaneousWoundHealing[J].CurrentMolecularMedicine, 2011,11(3),218-235.

[6]SemenzaGL.Hypoxia-induciblefactor1:oxygenhomeostasisanddiseasepathophysiology[J].TrendsMolMed, 2001,7(8):345-350.

[7]ThangarajahH,VialIN,GroganRH,etal.HIF-1alphadysfunctionindiabetes[J].CellCycle, 2010,9(1):75-79.

[8]MaceKA,YuDH,PaydarKZ,etal.SustainedofHIF-1αinthediabeticenvironmentpromotesangiogenesisandcutaneouswoundrepair[J].WoundRepairRegen, 2007,15(5):636-664.

[9]BelaibaRS,BonelloS,SchmidtS,etal.Hypoxiaup-regulateshypoxia-induciblefactor-1transcriptionbyinvolvingphosphatidylinositol3 -KinaseandnuclearfactorkappaBinpulmonaryarterymusclecells[J].MolBiolCell, 2007,18(12):4691-4697.

[10]YunSP,LeeMY,RyuJM,etal.RoleofHIF-1alphaandVEGFinhumanmesenchymalstemcellproliferationby17beta-estradiol:involvementofPKC,PI3K/Akt,andMAPKs[J].AmJPhysiolCellPhysiol, 2009,296:C317-C326.

[11]CeradiniDJ,KulkarniAR,CallaghanMJ,etal.ProgenitorcelltraffickingisregulatedbyhypoxicgradientsthroughHIF-1inductionofSDF-1[J].NatMed, 2004,10(8):858-864.

[12] 馮帥南, 黃 宏, 張 波, 等. 小鼠全層皮膚創(chuàng)傷愈合過程中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1及其受體CXCR4 基因表達(dá)的研究[J]. 感染·炎癥·修復(fù), 2008,9(3):141-145.

[13]LiuL,MartiGP,WeiX,etal.Age-dependentimpairmentofHIF-1alphaindiabeticmice:Correctionwithelectroporation-facilitatedgenetherapyincreaseswoundhealing,angiogenesis,andcirculatingangiogeniccells[J].JCellPhysiol, 2008,217(2):319-327.

Expression of HIF-1 α and target genes in wound of diabetic mice and its significance

JINGLi-feng,LIQin,LIShuang.

(DepartmentofPlasticSurgery,GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China)

Objective To investigate the expression of HIF-1α、VEGF、SDF-1α and CXCR4 mRNA at each time point during wound healing in BALB/c mice, probing mechanism of difficult healing of diabetic wound base on regulation of vascularization. Methods A full thickness round wound of 6 mm diameter was established on the back of mice at 4 weeks after the STZ injection. The skin specimens were harvested at 0、3、7、10 days after injury respectively and wound healing rate was calculated. The endogenous expressions of HIF-1α、VEGF、SDF-1α and CXCR4 mRNA and protein were measured by quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot analysis. Results The wound healing of diabetic mice was significantly less than normal mice (P<0.05),woundhealingrateof3、7、10dayswas(7.0±5.8)%, (38.7±6.0)%and(80.0±3.0)%,respectively,whichwerelowerthanthatinthecontrolgroup.ThemRNAexpressionofHIF-1α、VEGF、SDF-1、CXCR4indiabeticgroupwassignificantlylowerthanthatinnormalmicebeforeinjury(P<0.05).Theexpressionofobjectivegeneafterinjurywashigherthanthatbeforeinjury(P<0.05),basicallyitreachedthepeakat3and7days,butthetotalexpressionwaslowerthanthatinthecontrolgroup(P<0.05),whichhadthestatisticalsignificance. Conclusion The expression level of HIF-1α、VEGF、SDF-1α and CXCR4 decreased during wound healing of diabetic mice, resulting in insufficient angiogenesis, which may be a reason for the delay in diabetic wound healing.

Diabetic wound； HIF-1α； VEGF； SDF-1α； CXCR4

510010 廣東 廣州，廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 整形外科

景麗峰(1986-)，男，山西人，碩士.

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.04.016

R

A

1673-7040(2015)04-0239-04

2014-11-21)