慢病毒介導SOX9基因轉(zhuǎn)染小鼠脂肪干細胞的實驗研究

王 楷， 謝 亮， 李愛林

慢病毒介導SOX9基因轉(zhuǎn)染小鼠脂肪干細胞的實驗研究

王 楷， 謝 亮， 李愛林

目的 構(gòu)建攜帶SOX9基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染小鼠脂肪干細胞，觀察SOX9基因在脂肪干細胞中的表達。方法 將實驗分為3組，體外培養(yǎng)、分化小鼠ADSCs，行免疫熒光鑒定后，使用RT-PCR的方法獲取小鼠SOX9基因編碼區(qū)片段，將該片段克隆入質(zhì)粒Pwpxl-MOD2中產(chǎn)Pwpxl-MOD2-SOX9，將四質(zhì)粒Pwpxl-MOD2-SOX9、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共轉(zhuǎn)染包裝細胞293T,獲得目的基因SOX9基因的重組病毒(實驗組A)；同時轉(zhuǎn)染Pwpxl-MOD2，pRsv-REV，pMDlg-pRRE，pMD2G進另一組293T細胞包裝產(chǎn)生空載體慢病毒作為陰性對照(實驗組B)；未轉(zhuǎn)染組為實驗組C。收集病毒后，通過基因測序和限制性核酸內(nèi)切酶酶切的方法對質(zhì)粒進行鑒定。將包裝好的慢病毒Pwpxl-MOD2-SOX9體外轉(zhuǎn)染脂肪干細胞，利用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染是否成功，并通過流式細胞儀測定轉(zhuǎn)染效率。同時，利用RT-PCR和Western blot 檢測小鼠 SOX9 基因的表達。結(jié)果 成功分離、培養(yǎng)大鼠的脂肪干細胞；酶切、PCR及測序鑒定證實，慢病毒載體質(zhì)粒Pwpxl-MOD中插人片段為基因SOX9，包裝產(chǎn)生的病毒能較為高效轉(zhuǎn)染小鼠脂肪干細胞。RT-PCR 和 Western blot 檢測顯示，經(jīng) SOX9 基因轉(zhuǎn)染的小鼠脂肪干細胞表達目的基因產(chǎn)物。結(jié)論 成功構(gòu)建SOX9基因的慢病毒載體并感染脂肪干細胞后能夠穩(wěn)定表達SOX9，這為慢病毒及 SOX9 基因在軟骨組織工程學中的進一步研究奠定了基礎。

慢病毒； 脂肪干細胞； SOX9基因

隨著物質(zhì)生活水平的提高，人們對于美學的要求越來越高，而在整形美容中，利用假體材料進行整形美容手術(shù)，往往難以取得令人滿意的結(jié)果，并會出現(xiàn)術(shù)后并發(fā)癥。而軟骨作為最早應用組織工程技術(shù)成功構(gòu)建的組織之一[1]，卻發(fā)展較為緩慢，原因是缺乏軟骨種子細胞。2001年，Zuk等[2]發(fā)現(xiàn)，脂肪抽吸物中存在具有骨、軟骨、脂肪、肌肉等多向分化潛能的細胞。Gronthos等[3]進一步證實，脂肪組織中確實存在具有間充質(zhì)干細胞特性的細胞。脂肪干細胞(adipose stromal cells, ASCs)為多向分化潛能的干細胞[4]。Furumatsu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，SOX9基因在間充質(zhì)細胞濃集和軟骨形成階段起關(guān)鍵作用。目前，慢病毒載體以其具有高效、安全和穩(wěn)定表達等優(yōu)點成為基因治療的理想載體。自2012年5月開始，我們研究構(gòu)建含SOX9基因的慢病毒載體，并感染ADSCs，進而檢測SOX9基因在ADSCs中的穩(wěn)定表達。

1 材料與方法

1.1 儀器與動物 實驗動物 ICR小鼠(25 g)，由武漢大學動物實驗中心提供。儀器:倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，DYY-6C型電泳電源(北京六一儀器廠)，PCR儀(美國STRATAGENE公司)，膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.2 主要試劑 慢病毒載體Pwpxl-MOD由中國科學院上海生命科學研究院提供，其中載體質(zhì)粒Pwpxl-MOD2能表達綠色熒光蛋白(GFP)，小、大量抽提試劑盒，凝膠回收試劑盒購自湖北百奧斯公司；慢病毒包裝細胞293T購自美國GENECOPOEIA公司；KOD-PLUS購自日本TOYOBO公司；Trizol、胎牛血清、胰蛋白酶均購自湖北百奧斯公司；引物由美國GENECOPOEIA公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于國家日本TAKARA公司；抗小鼠SOX9一抗、抗小鼠collagen-Ⅱ購自北京博奧森公司；抗小鼠B-aetin-抗購自天津三箭公司；二抗購自北京博奧森公司。

2 方法

2.1 細胞傳代培養(yǎng) 采用細胞體外培養(yǎng)頸椎脫臼法處死ICR小鼠，在無菌條件下切取小鼠腹部脂肪組織，仔細清除組織中肉眼可見的小血管和結(jié)締組織，PBS沖洗5遍后剪碎，加人3倍體積0.1%的Ⅰ型膠原酶，37 ℃、水浴震蕩消化50～70 min；加入等體積的高糖DMEM(含15%FBS)，1500 r/min離心10 min，傾去上層脂肪及上清液，沉淀；用含15%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋，200目濾網(wǎng)過濾、離心，將細胞收集到25 ml培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO孵箱中培養(yǎng)；48～72 h首次換液，去除未貼壁細胞；之后每2～3 d換液，5～7 d細胞長滿80%～90%時，用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化傳代培養(yǎng)。

2.2 細胞培養(yǎng)后觀察 向4孔內(nèi)滴加CD44、CD29、CDl06、CD34兔抗小鼠多克隆抗體(1∶100)300 μl棄去一抗，PBS清洗3遍后，向每孔加入300 μl羊抗兔FITC標記的二抗(1∶100)，室溫孵育2 h后，棄二抗PBS，清洗3遍，熒光顯微鏡下觀察并照相。

2.3 PCR方法獲取基因片段 自Gene bank中獲得小鼠SOX9的cDNA序列(NM_011448.4)，上游引物選用BamH I，下游引物選用EcoR I。上游引物序列為:5′-AATICGGGATCCATGAATCTCCTGGACCCC-3′ ,下游引物序列為：5′-ATTGACCGAATTCGATCAAGGTCGAGTGAGC-3′，擴增出的PCR產(chǎn)物約為1530 bp。從小鼠肝臟中抽提總RNA，并利用RT-PCR反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以該cDNA為模板，利用上述引物PCR擴增得到SOX9基因片段。PCR反應體系為：模板l μl，10×Buffer 2 μl，dNTP2 μl，KOD-2PLUS 1.0 μl，Primers l.0μl，dH2O加至20 μl反應體系。PCR反應條件為：95 ℃10 min，95 ℃10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)，最后經(jīng)72 ℃總延伸10 min。目的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、回收，獲得SOX9基因片段。

2.4 慢病毒載體構(gòu)建 將產(chǎn)物進行凝膠電泳后回收，對回收產(chǎn)物分別用BamH I和EcoR I進行雙酶切，用DNA純化試劑盒進行純化，再用T4連接酶將雙酶切載體和目的基因片段進行連接反應。

2.5 慢病毒包裝、轉(zhuǎn)染和滴度檢測 將293T細胞胰蛋白酶消化，接種于25 ml的細胞培養(yǎng)皿中，將慢病毒包裝系統(tǒng)中4種質(zhì)粒DNA溶液和磷酸鈣混合，轉(zhuǎn)移至含單層細胞的培養(yǎng)液中，混勻；培養(yǎng)12 h后，棄去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)液，加入PBS 15 ml，輕搖后棄去，重復該步驟3次；收集轉(zhuǎn)染72 h的293T細胞上清液；將收集的上清液于4 ℃，4000 r/min離心10 min，收集上清液；72 000 r/min離心120 min；4 ℃溶解過夜。病毒-70 ℃儲存待用。于檢測前1 d，向24孔板中各加入1×105個293T細胞待轉(zhuǎn)染。次日取10 μl的病毒原液，逐次稀釋10倍，共獲得8個梯度的病毒液，然后分別轉(zhuǎn)染293T 細胞。4 d后，用Trizol 提取總RNA 進行qPCR測定。按TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過比較對照組與實驗組的Ct 值差異，判斷滴度值。

2.6 慢病毒載體感染ADSCs 取第3代生長狀態(tài)良好的ADSCs，細胞達到70%～80%融合時，分別加入SOX9慢病毒載體及空慢病毒載體，以未感染慢病毒的ADSCs作為對照組。感染復數(shù)為50，輕輕混勻，培養(yǎng)箱中37 ℃過夜培養(yǎng)，48 h后熒光顯微鏡觀察綠色熒光的表達。同時提取蛋白進行Western Blot檢測SOX9的表達情況。

2.7 RT-PCR及檢測SOX9的表達 提取細胞總RNA，β-aetin作內(nèi)參。SOX9上游引物序列為：5′-TTCATGAAGATGACCGACGAGCAG-3′，下游引物序列為：5′-ACTTAATCCGGGTGGTCCTTCT-3′，擴增產(chǎn)物長度為490 bp；β肌動蛋白上游引物序列為：5′-AGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGT-3′，下游引物序列為：5′-TCTCCGTTTCTGCGCCGTTAGGTTT-3′，擴增產(chǎn)物長度為198 bp。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，凝膠成像系統(tǒng)成像拍照。

3 結(jié)果

3.1 ASCs的分離培養(yǎng) 原代培養(yǎng)的ASCs 24 h即可見細胞貼壁，多數(shù)貼壁細胞呈圓形，其中散在少量的梭形細胞或多角細胞；3 d后梭形細胞逐漸增多，可見核分裂相；5 d后細胞呈團簇狀生長，形成集落；約7 d細胞融合超過90%時，傳代3代后細胞形態(tài)比較均一，成長梭形(圖1)。

3.2 慢病毒載體的構(gòu)建 構(gòu)建出的慢病毒載體用BamH I/EcoR I雙酶切，取酶切產(chǎn)物10 μl檢測鑒定，經(jīng)上海GENECHEM 公司進行DNA 測序和比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測序結(jié)果與目標序列完全一致(1530 bp)，說明SOX9過表達載體構(gòu)建成功(圖2)。

3.3 慢病毒質(zhì)粒在293T細胞中的表達 目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞24 h后，觀察熒光的表達情況。未經(jīng)目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細胞作為對照。經(jīng)目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后的293T細胞，可以觀察到綠熒光的表達(圖3)。

3.4 慢病毒滴度測定 在本實驗滴度檢測中，實驗組和對照組樣品的Ct值存在1個左右差異，認為在實驗組樣品中存在病毒顆粒。又因為RNA 逆轉(zhuǎn)錄獲得9 μl cDNA，而進行qPCR測定只用了1 μl，因此滴度為：9/(1×10-4～1×10-3)=9×107TU/ml。

3.5 RT-PCR檢測結(jié)果 基因轉(zhuǎn)染48 h后，提取細胞總RNA進行RT-PCR分析，結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)一大小約490 bp的條帶，符合預期結(jié)果，而未轉(zhuǎn)染組未發(fā)現(xiàn)SOX9基因的表達(圖4)。

3.6 Western Blot 結(jié)果 轉(zhuǎn)染2周后提取細胞總蛋白進行印記分析，結(jié)果顯示SOX9基因可以檢測到陽性條帶，其大小與SOX9融合蛋白相吻合，對照組未檢測到明確的陽性條帶(圖5)。

圖1 細胞形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)ADSCs呈梭型、多角形和扁平型(×40) 圖2 BamHl/EcoR l酶切鑒定(1號克隆為陽性克??； M為標準參照物) 圖3 慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細胞24 h a. 經(jīng)轉(zhuǎn)染293T b. 未經(jīng)轉(zhuǎn)染293T 圖4 基因轉(zhuǎn)染48 h后RT-PCR檢測 圖5 基因轉(zhuǎn)染48 h后Western Blot 檢測

Fig 1 Cell morphology showed spindle shaped, polygonal and flat type ADSCs (×40). Fig 2 The BamHl/EcoR l enzyme cutting identification (Clone 1: positive clones; M: the standard reference material). Fig 3 Transfected 293T cells by Lentiviral vector at 24 hours.a. Transfected 293T cells. b. non-transfected 293T cells. Fig 4 Transfected gene detected by RT-PCR at 48 hours. Fig 5 Transfected gene detected by Western Blot at 48 hours.

4 討論

軟骨細胞是構(gòu)建軟骨組織效果最理想的種子細胞，但人體內(nèi)可使用的軟骨細胞數(shù)量極為有限，存在取材創(chuàng)傷大、多次傳代后又極易發(fā)生老化與去分化等問題，喪失軟骨形成能力，因此，應用軟骨細胞構(gòu)建軟骨組織在臨床上難以推廣應用。ASCs具有分布廣泛、可利用細胞量大、取材容易等優(yōu)點[6]，為ASCs作為種子細胞應用于組織工程研究提供了可能。

Sox9基因是一種重要的早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因，擁有位于羥基端HMG結(jié)構(gòu)域及位于氨基端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，參與諸如性別決定、軟骨形成等多種早期胚胎發(fā)育過程，在除肥大的軟骨細胞外的所有軟骨前體細胞和軟骨細胞中均有表達,SOX9屬于SOX基因家族E亞組，具有典型的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)。研究證明，SOX9主要在軟骨細胞中表達，是軟骨發(fā)育形成過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，對軟骨的發(fā)育成熟等過程起著重要的調(diào)節(jié)作用，在胚胎發(fā)育過程中，SOX9基因決定間充質(zhì)干細胞的聚集和向軟骨細胞的分化[7-9]，如果SOX9失活，其軟骨分化被遏制。SOX9可以與SOX5、SOX6 等分子共同作用，促進軟骨細胞的增殖，激活軟骨細胞特征分子如Ⅱ型膠原、aggrecan蛋白等的表達，從而調(diào)控軟骨分化[10-11]。

慢病毒載體屬于一種新型的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其感染宿主細胞后不會再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產(chǎn)生新的病毒顆粒，故該病毒具有極高的生物安全性[12]。慢病毒載體的最大優(yōu)勢在于可以同時高效感染分裂期和非分裂期的細胞, 而且目的基因可以在宿主細胞中持續(xù)穩(wěn)定表達[13-14]，因此，慢病毒成為目前基因治療技術(shù)中較理想的載體。

本實驗中，我們通過將獲得的SOX9基因與Pwpxl-MOD2質(zhì)粒經(jīng)酶切后，成功形成重組慢病毒載體Pwpxl-MOD2-SOX9。經(jīng)DNA 測序和比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測序結(jié)果與目標序列完全一致，說明SOX9過表達載體構(gòu)建成功。慢病毒載體Pwpxl-MOD2-SOX9轉(zhuǎn)染小鼠ASCs 48 h后，經(jīng) RT-PCR 檢測，A 組細胞出現(xiàn)SOX9 mRNA 的表達，而對照組未見SOX9基因的表達。Western blot 結(jié)果顯示，A組細胞開始表達目的蛋白SOX9，證實SOX9目的基因已成功轉(zhuǎn)染 ADSCs 并獲得表達。A組倒置熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)綠色熒光的表達，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率約為73.1%。

綜上所述，本實驗中攜帶小鼠SOX9 基因的慢病毒載體被成功構(gòu)建，并且高效轉(zhuǎn)染小鼠脂肪干細胞獲得穩(wěn)定表達SOX9 的宿主細胞。這為進一步研究SOX9 基因促進脂肪干細胞成軟骨分化及慢病毒載體在軟骨組織工程中的應用奠定了一定的實驗基礎。目前，軟骨組織工程各方面的研究發(fā)展迅速，但距其在臨床方面的實際應用還有較大差距。整合外來基因的種子細胞，形成了組織工程軟骨，能否應用于組織替代或重建尚需進一步研究。

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Experimental study of lentiviral vector of SOX9 gene transducing adipose stromal cells

WANGKai,XIELiang,LIAi-lin.

(DepartmentofCosmeticSurgery,WuhanHuayaPlasticHospital,Wuhan430060,China)

Objective To construct the lentiviral vector containing SOX9 gene and to detect its expression in ADSCs derived from mouse fat and observe the expression of target gene. Methods ADSCs divided into 3 groups were isolated, cultured, and then identified by immunofluorescence assay, mice SOX9 gene coding region fragment was obtained by RT-PCR and then cloned into the plasmid of Pwpxl-MOD2 to form Pwpxl-MOD2/SOX9. Pwpxl-MOD2/SOX9, pRsv-REV, pMDlg-pRRE and pMD2G were co-transfected into 293T cells to obtain recombinant virus containing SOX9 gene (Group A). Meanwhile Pwpxl-MOD2, pRsv-REV, pMDlg-pRRE and pMD2G were transfected into another group of 293T cells as a control group packing into blank Lentiviral vector (Group B), the untransfected group as the experimental group C. Then the packed Lentiviral vector was transfected into ADSCs which derived from mouse fat, and the Lenti-SOX9-ADSCs was selected by inversion fluorescence microscope. The expression of SOX9 gene was detected by RT-PCR and Western blot. Results We succeeded in separating and culturing mice ADSCs; the sequencing and restriction analysis showed that SOX9 gene fragment was correctly connected and cloned into the plasmid Pwpx1-MOD in Lentiviral vectors. The expression of Sox9 gene was confirmed by RT-PCR and Western blot. Conclusion Lenti-SOX9-ADSCs has the phenotypes of chondrocytes, and providing reliable genetic basis for the tissue-engineering in plastic applications.

Lentivirus； Adipose stromal cells； SOX9 gene

湖北省自然科學基金資助項目(2012FFB04425)

430060 湖北 武漢，武漢華亞美容醫(yī)院 美容外科(王 楷)；湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院 燒傷整形科(謝 亮)；武漢大學人民醫(yī)院 整形外科(李愛林)

王 楷 (1988-)，男，湖北人，醫(yī)師，碩士.

李愛林，430060，武漢大學人民醫(yī)院 整形外科，電子信箱：superlin123@126.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.04.012

R-332

A

1673-7040(2015)04-0224-04

2014-12-26)