Hedgehog信號通路在增生性瘢痕中的表達及意義

趙孝開， 潘 姝， 謝有富， 祁少海， 方 力， 戴麗冰

作者單位：510220 廣東 廣州，暨南大學附屬廣州市紅十字會醫(yī)院 燒傷整形科

實驗研究

Hedgehog信號通路在增生性瘢痕中的表達及意義

趙孝開， 潘 姝， 謝有富， 祁少海， 方 力， 戴麗冰

目的 探討Hedgehog信號通路分子Shh、Patch、Smo及Gli-1在增生性瘢痕中的表達及意義。方法 增生性瘢痕病患者的瘢痕標本28例，患者手術時取皮修剪后的殘余全厚皮片的正常皮膚15例。應用免疫組化、實時熒光定量PCR和Western Blot檢測Shh、Patch、Smo及Gli-1在增生性瘢痕及正常皮膚中的表達情況。結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，Hedgehog信號通路分子Shh、Patch、Smo及Gli-1在增生性瘢痕及正常皮膚中均有表達，表達部位主要位于成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞的胞漿或胞膜，其在增生性瘢痕中的表達強度均高于正常皮膚，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實時熒光定量PCR和Western Blot檢測顯示，增生性瘢痕組織中Shh、Patch、Smo及Gli-1在mRNA和蛋白水平的表達均高于正常皮膚組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 增生性瘢痕中Shh、Patch、Smo及Gli-1在mRNA和蛋白水平的表達均增高，提示Shh信號通路活性增加可能在增生性瘢痕產(chǎn)生及發(fā)展過程中起到重要作用。

增生性瘢痕； Hedgehog信號通路； Shh ； Patch； Smo； Gli-1

增生性瘢痕可導致嚴重的功能障礙。治療增生性瘢痕的方法主要有手術切除、加壓療法、類固醇激素等[1-2]，但瘢痕增生及復發(fā)遠沒有達到控制。Hedgehog信號通路在胚胎發(fā)育過程中的細胞分化增殖和許多器官的創(chuàng)傷愈合中起到重要作用，其與多種腫瘤的再生、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關[3]。近年許多研究顯示,該通路與肝纖維化和腎臟纖維化等疾病密切相關[4-6]。增生性瘢痕是一種皮膚組織纖維化疾病，該信號通路是否也與增生性瘢痕存在關系，自2014年7月至2015年2月，我們通過觀察測定增生性瘢痕與正常皮膚組織中該信號通路關鍵分子的表達情況，以期為增生性瘢痕的治療提供新的思路和靶點。

1 對象與方法

1.1 主要試劑 兔抗小鼠Shh、Smo、Gli-1多克隆抗體購自北京博奧森生物公司，兔抗鼠Patch多克隆抗體購自美國ORIGENE公司，免疫組化SP試劑盒與DAB顯色劑購自福建邁新生物公司。

1.2 標本來源 增生性瘢痕病患者的瘢痕標本28例,男性15例,女性13例；年齡1～39歲。術前均未行其他治療。瘢痕處于增生期, 取材部位：上肢12例,軀干3例，面部5例,下肢8例。正常皮膚15例，為患者手術時取皮修剪后的殘余全厚皮片。

1.3 標本采集及處理 標本取材后，分為3份，一份標本經(jīng)固定，脫水,透明，包埋后制成石蠟塊，行3 μm切片用于免疫組化染色。另外兩份保存于液氮，分別用于Western Blot和RT-PCR檢測。

1.4 標本的免疫組織化學染色 免疫組織化學法檢測參照試劑盒說明書進行。石蠟切片脫蠟、水化及抗原修復后,PBS沖洗3次,每次3 min,1%BSA室溫封閉15 min，加一抗，4 ℃冰箱過夜(各抗體稀釋濃度均為1∶200)，二抗室溫下孵育20 min，滴加DAB，蘇木素復染3 min,流水稍沖洗，鹽酸乙醇分化，梯度脫水透明，中性樹膠封片，PBS代替一抗做陰性對照，光學顯微鏡下觀察染色結(jié)果，高倍光學顯微鏡下取5個觀察視野，應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行各抗體蛋白面密度(陽性顆粒的總面積及光密度值，然后計算出單位面積的面密度值)。

1.5 實時熒光定量PCR法檢測Shh、Patch、Smo和Gli-1 mRNA的表達 按Trizol試劑說明書方法提取總RNA，按Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在GenBank上查找目的基因mRNA序列，在CDS區(qū)設計特異性引物，用Primer express 2.0軟件設計特異性引物，美國INVITROGEN公司3900型臺式高通量DNA合成儀合成，序列如下：Shh (片段長度108 bp) 上游引物: 5′-CAGCGGAAGGTATGAAGGGA-3′，下游引物: 5′-GCTCCGGTGTTTTCTTCATCC-3′；Patch (片段長度110 bp) 上游引物: 5′-CGAGATACAAGCCTGTA-3′，下游引物: 5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′；Smo(片段長度115 bp) 上游引物: 5′-GTGCGAAGTGCCCTTGGTT-3′ ，下游引物: 5′-CATGTCCTGGTGCTCAGCCT-3′；Gli-1(片段長度111 bp) 上游引物: 5′-AGATCCTAGCTCGCTGCGAA-3′，下游引物:5′-GTAGAAATGGATGGTGCCCG-3′；GAPDH(片段長度96 bp)上游引物：5′-GATTCCACCCATGGCAAATT-3′，下游引物：5′-TCTCGCTCCTGG AAGATGGT-3′。采用美國ABI公司7300型全自動熒光定量PCR儀，反應條件為：93 ℃預變性2 min，然后93 ℃15 s，55 ℃25 s，72 ℃25 s，共40循環(huán)，采用BioRad CFX Manager軟件分析Shh、Gli-1 基因和GAPDH基因的擴增曲線，得到各實驗孔的Ct值，分別計算同一個cDNA樣本中3個復孔的Ct 均值，并以同一個樣本中的GAPDH Ct值作為內(nèi)參照，并進一步用2-△△CT法計算基因的相對表達水平。

1.6 Western Blot檢測Shh和Gli-1蛋白的表達 常規(guī)提取組織蛋白，測定其濃度，各組加入20 μg蛋白樣本，加入5×上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，400 mA電流轉(zhuǎn)膜120 min，5%牛血清白蛋白封閉2 h，1×TBST洗滌3次，10 min/次，加入一抗，4 ℃孵育過夜，二抗孵育1 h，1×TBST充分漂洗后用ECL試劑盒顯色。所有內(nèi)參對照均使用小鼠抗GAPDH (稀釋度為1∶7000)。所得圖像均用image lab軟件掃描作灰度分析 (目的蛋白/GAPDH的比值)。

2 結(jié)果

2.1 人增生性瘢痕及正常皮膚Shh、Patch、Smo和Gli-1蛋白免疫組化檢測結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，Shh和Gli-1在增生性瘢痕及正常皮膚組織中均有表達，顯微鏡下Shh的染色主要位于細胞質(zhì)，染色為均勻棕黃色，既在表皮細胞也在真皮層成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞中表達；Gli-1陽性染色主要位于胞質(zhì)或胞核，也為棕黃色(圖1～4)；Patch蛋白在增生性瘢痕中成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞呈陽性表達，而在正常皮膚組織中在表皮基底層細胞及血管內(nèi)皮細胞有少量表達(圖5～6)；Smo蛋白在增生性瘢痕中的成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞中均有強陽性表達，主要表達部位位于胞膜及胞質(zhì)，染色為深棕色，在正常皮膚組織少部分真皮層成纖維細胞胞漿有陽性表達，染色為棕黃色(圖7～8)。上述4種蛋白在增生性瘢痕中的表達量均比在正常皮膚組織中高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

2.2 熒光定量PCR檢測增生性瘢痕和正常皮膚組織中Shh、Patch、Smo和Gli-1 mRNA表達結(jié)果 熒光定量PCR結(jié)果顯示，Shh、Patch、Smo、Gli-1 mRNA在增生性瘢痕中的表達量均較正常皮膚組織中高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

2.3 Western Blot法檢測人增生性瘢痕及正常皮膚Shh和Gli-1蛋白表達結(jié)果 Shh和Gli-1蛋白在增生性瘢痕及正常皮膚均有表達(圖9)，在增生性瘢痕中表達量均較正常皮膚高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

表1 免疫組化檢測Shh、Patch、Smo和Gli-1蛋白在增生性瘢痕和正常皮膚中的表達

組織ShhPatchSmoGli?1增生性瘢痕0．245±0．013?0．259±0．016?0．334±0．028?0．232±0．026?正常皮膚0．161±0．0270．120±0．0170．171±0．0140．163±0．015t值25．0560．4557．6424．27P值0．000．000．000．00

注：*與正常皮膚相比，P<0.05

表2 RT-PCR檢測Shh、Patch、Smo、Gli-1 mRNA在增生性瘢痕 和正常皮膚中的表達

組織ShhPatchSmoGli?1增生性瘢痕13．27±2．89?16．17±1．35?22．38±5．69?12．52±2．75?正常皮膚4．56±0．876．43±1．369．78±1．804．86±1．97t值11．3422．5110．769．52P值0．0340．0170．040．24

注：*與正常皮膚相比P<0.05

表3 Western Blot法檢測Shh、Gli-1蛋白在增生性瘢痕和正常 皮膚中的表達

組織ShhGli?1增生性瘢痕0．66±0．04?0．56±0．06?正常皮膚0．36±0．050．34±0．05t值15．349．12p值0．000．00

注：*與正常皮膚相比P<0.05

3 討論

Hedgehog是一種可以共價結(jié)合膽固醇的分泌性蛋白，Hedgehog信號傳導通路由Hh配體、膜蛋白受體復合物、核轉(zhuǎn)錄因子和下游靶基因組成[7]。Hh的同源基因有3種，即Shh、Ihh和Dhh。目前對Shh進行的研究較多，Shh信號對靶細胞的作用是通過介導Patch和Smo這2個跨膜蛋白受體來實現(xiàn)的，Patch是由單一肽鏈構成的，這些肽鏈擁有12個跨膜區(qū)，其發(fā)揮著負調(diào)控的作用。Smo是由擁有7個跨膜區(qū)的單一肽鏈構成的，是Hedgehog信號通路傳遞所必須的蛋白受體。在沒有Hh、Patch情況下，激活Smo可導致Hedgehog下游相關目的靶基因的活化[8]。Hedgehog通路在動物胚胎發(fā)育中起著非常重要的作用[9]，在成熟組織器官中，Hedgehog通路的活化在干細胞調(diào)控、組織損傷修復和血管再生等方面也發(fā)揮著關鍵作用。Hh蛋白可激活整條通路，它能通過Patch和Smo向細胞內(nèi)傳遞信號，激活下游轉(zhuǎn)錄因子Gli，激活的Gli又可介導相關目的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白的合成。在未與Hh結(jié)合的情況下，Patch抑制Smo蛋白的活性，從而抑制下游相關靶基因的轉(zhuǎn)錄。當Patch和Hh蛋白結(jié)合以后，解除Patch對Smo的抑制作用，Smo在細胞表面聚集激活，促使Gli蛋白與PKA形成復合物進入胞核，激活下游相應靶基因轉(zhuǎn)錄。同時Hh通路又能夠負反饋誘導Patch的轉(zhuǎn)錄。當Patch產(chǎn)生突變或者缺失時，或 Smo突變致對Patch抑制作用不敏感，這一系列情況將會造成Hh通路失控，其結(jié)果將會造成Gli持續(xù)激活，啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄。

本研究發(fā)現(xiàn)，在增生性瘢痕中，Hedgehog通路中關鍵因子Shh、Patch、Smo和Gli-l在增生性瘢痕和正常皮膚組織中均有表達，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,Shh、Patch、Smo和Gli-1 mRNA在增生性瘢痕中的表達量高于其在正常皮膚中的表達，差異有統(tǒng)計學意義；Western Blot檢測顯示，Shh、Gli-1蛋白在增生性瘢痕中表達高于正常皮膚，同樣免疫組化結(jié)果也顯示Shh、Patch、Smo和Gli-1蛋白在增生性瘢痕中的表達量明顯高于正常皮膚，這一系列的Hedgehog信號通路分子在增生性瘢痕中高表達,提示我們該信號通路與增生性瘢痕的形成存在一定的聯(lián)系。早期研究顯示，Hedgehog信號通路與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲和再生密切相關[3]，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，其調(diào)控作用還涉及到組織損傷過程中細胞遷移、增殖、分化及修復[10]。有學者發(fā)現(xiàn)，Hedgehog信號通路與HSC活化有關，HSC的異?；罨鲋呈歉卫w維化發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)，過度或持續(xù)的Hedgehog通路激活能夠?qū)е率軗p肝臟組織過度再生，進而促進肝纖維化發(fā)生[11-12]。Guy等[13]在研究肝臟損傷時發(fā)現(xiàn)，損傷的肝臟中Hh 信號通路處于激活狀態(tài)，且肝臟損傷程度與Hh信號通路活化水平呈正相關，同時Hh信號通路活化可刺激肝臟內(nèi)成纖維細胞的生長，從而促進肝臟纖維化。章麗娜[14]研究指出，預防性使用環(huán)巴胺能有效抑制Hh信號通路的活化，減少α-SMA生成并減輕小鼠肝纖維化程度。Philips等[15]研究指出，給予大鼠肝損傷模型中應用Hh通路特異性抑制劑GDC-0449可以改善大鼠肝纖維化程度。

圖1 Shh在增生性瘢痕中的表達(SP ×200) 圖2 Shh在正常皮膚中的表達(SP ×200) 圖3 Gli-1在增生性瘢痕中的表達(SP ×200) 圖4 Gli-1在正常皮膚中的表達(SP ×200) 圖5 Patch在增生性瘢痕中的表達(SP ×200) 圖6 Patch在正常皮膚中的表達(SP ×200) 圖7 Smo在增生性瘢痕中的表達(SP ×200) 圖8 Smo在正常皮膚中的表達(SP ×200) 圖9 Western Blot 檢測Shh和Gli-1蛋白在增生性瘢痕和正常皮膚中的表達

Fig 1 Shh expression in hypertrophic scar (SP ×200). Fig 2 Shh expression in normal skin (SP ×200). Fig 3 Gli-1 expression in hypertrophic scar (SP ×200). Fig 4 Gli-1 expression in normal skin (SP ×200). Fig 5 Patch expression in hypertrophic scar (SP ×200). Fig 6 Patch expression in normal skin (SP ×200). Fig 7 Smo expression in hypertrophic scar (SP ×200). Fig 8 Smo expression in normal skin (SP ×200). Fig 9 Shh and Gli-1 expression in hypertrophic scar and normal skin detected Western Blot.

我們推測Hedgehog信號通路的異常激活可能參與了增生性瘢痕的形成和發(fā)展，阻斷該通路是否會達到抑制瘢痕增生的效果？我們下一步將在體內(nèi)實驗中進一步研究該通路在增生性瘢痕發(fā)生中的作用，以期為增生性瘢痕的早期治療提供新的思路和方法。

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Expression of Hedgehog signal pathway in hypertrophic scar and its significance

ZHAOXiao-kai,PANShu,XIEYou-fu,etal.

(DepartmentofBurnsandOrthopedics,GuangzhouRedCrossHospital,Guangzhou510220,China)

Objective To investigate the expression of Shh, Patch, Smo and Gli-1 of Hedgehog signal pathway in hypertrophic scar and its significance. Methods Twenty-eight specimens of hypertrophic scar from the patients who underwent plastic surgery and 15 specimens of normal skins from the same patients were collected in our hospital. Immunohistochemistry, Real-time PCR and Western Blot were applied to detect the mRNA and protein expressions of Shh, Patch, Smo and Gli-1 in both hypertrophic scars and normal skins. Results Shh, Patch, Smo and Gli-1, the elements of Hedgehog signal pathway, were mainly detected in cell membrane and cytoplasm of fibroblast and endothelial cells of hypertrophic scars and normal skins. The expressions of them in hypertrophic scars were significantly higher than those in normal skins (P<0.05). The expressions of Shh, Patch, Smo and Gli-1 were significantly increased in hypertrophic scars at both mRNA and protein levels. Conclusion The expressions of Shh、Patch、Smo and Gli-1 mRNA and protein were elevated in hypertrophic scars which indicated that the abnormal activity of Hedgehog signal pathway plays an important role in the occurrence of the hypertrophic scar.

Hypertrophic scar; Hedgehog signal pathway; Shh; Patch; Smo; Gli-1

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技重點項目基金資助項目(20121A021010)

作者單位：510220 廣東 廣州，暨南大學附屬廣州市紅十字會醫(yī)院 燒傷整形科

趙孝開(1987-)，男，河南人，碩士研究生.

潘 姝，510220，暨南大學附屬廣州市紅十字會醫(yī)院 燒傷整形科，電子信箱：lionps@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.07.018

R619.6

A

1673-7040(2015)07-0432-04

2015-05-29)