美洲鰣魚(yú)精子超低溫冷凍保存技術(shù)初探

王明華　陳友明　丁淑燕　鐘立強(qiáng)　秦欽　邊文冀　蔡永祥　陳校輝

摘要：對(duì)美洲鰣魚(yú)精液的超低溫冷凍保存技術(shù)進(jìn)行了研究。以解凍后精子的活力為參數(shù)，探討了魚(yú)用任氏液為稀釋液、不同體積分?jǐn)?shù)甲醇為保護(hù)劑、不同凍前平衡時(shí)間以及不同精液稀釋比對(duì)美洲鰣魚(yú)精液進(jìn)行超低溫冷凍保存的保護(hù)效果。結(jié)果顯示，以魚(yú)用任氏液和體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醇組成抗凍保護(hù)劑，精液稀釋比（精液與抗凍保護(hù)劑的體積比）為1 ∶3 ，于4 ℃冰箱平衡20 min，液氮面上方6 cm處平衡10 min，然后在液氮面上平衡5 min，最后投入液氮中的保存方式，保存60 d后檢查精子活力，存活率可達(dá)80%。研究結(jié)果為保護(hù)淡水魚(yú)類的種質(zhì)資源提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：美洲鰣魚(yú)；精液；抗凍保護(hù)劑；超低溫保存

中圖分類號(hào)： S965.219.12 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0250-02

美洲鰣魚(yú)（Alosa sapidissima）屬鯡形目鯡科，魚(yú)肉細(xì)脂厚，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，為集約化養(yǎng)殖的優(yōu)良品種。美洲鰣魚(yú)與我國(guó)的長(zhǎng)江鰣、富春江鰣同科不同地理種群，且其自然分布水域緯度相同，肉味和外形也基本一致。據(jù)調(diào)查，由于野生資源的破壞，已有十多年未能在長(zhǎng)江捕到長(zhǎng)江鰣魚(yú)，資源瀕臨滅絕，恢復(fù)長(zhǎng)江鰣魚(yú)資源已經(jīng)很難。自2003年美洲鰣魚(yú)被引進(jìn)中國(guó)作為長(zhǎng)江鰣魚(yú)的替代品[1] ，美洲鰣魚(yú)養(yǎng)殖在中國(guó)呈現(xiàn)出廣闊的市場(chǎng)前景[2]。精子超低溫保存技術(shù)能為珍稀物種和重要經(jīng)濟(jì)種類基因資源的長(zhǎng)期保存提供有效的技術(shù)手段，在繁殖生物學(xué)、遺傳育種和種質(zhì)資源保護(hù)等方面具有重要意義。超低溫保存是一種有效的并能長(zhǎng)期保存鮮精的方法[3]。迄今為止約有200多種海淡水魚(yú)類被用于超低溫保存研究[4-5]，而關(guān)于美洲鰣魚(yú)精液的超低溫保存研究卻未見(jiàn)報(bào)道，本研究開(kāi)展美洲鰣魚(yú)精子超低溫冷凍保存技術(shù)研究，為更好地保護(hù)利用優(yōu)良美洲鰣魚(yú)種質(zhì)資源提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

美洲鰣魚(yú)精子樣品來(lái)源于南通龍洋水產(chǎn)有限公司海安中洋河鲀莊園養(yǎng)殖的美洲鰣魚(yú)親本，它們生長(zhǎng)良好、形態(tài)正常、無(wú)疾病、達(dá)到性成熟。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 精子采集 2014年5月15日，采用促黃體釋放激素類似物（LHRH-A2）、促絨毛膜性腺激素（HCG）、馬來(lái)酸地歐酮 （DOM）、魚(yú)類催產(chǎn)助劑對(duì)挑選的成熟雄魚(yú)進(jìn)行注射催情；同年5月16日采取擠壓法采集精子。所采集的精液要求乳白色，無(wú)血污、糞便污染。采集的精液于4 ℃冰箱中暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鮮精質(zhì)量的檢測(cè) 先用細(xì)口吸管吸1滴激活液于載玻片上，對(duì)準(zhǔn)視野，然后用解剖針針尖在裝有精液的培養(yǎng)皿中挑取適量精液，取出后立即在載玻片上的激活液中攪勻觀察，激活液激活后測(cè)活力。觀察3～5個(gè)視野，精子活力（存活率）統(tǒng)計(jì)方法為估測(cè)視野中活動(dòng)精子的數(shù)量占全部精子數(shù)量的百分比，取其平均值，選取活力達(dá)90%以上的精子作為后續(xù)試驗(yàn)材料進(jìn)行冷凍保存。

1.2.3 稀釋液和抗凍劑 稀釋液為魚(yú)用任氏液，配制方法為：0.780 g NaCl，0.021 g CaCl2，0.020 g KCl，0.200 g NaHCO3 加雙蒸水至1 L，pH值8.0。 抗凍劑為甲醇，分別配制了5%、10%、15%3個(gè)不同體積分?jǐn)?shù)，置4 ℃冰箱預(yù)冷備用。

1.2.4 精子冷凍保存方法 精子于4 ℃冰箱分別平衡0、10、20、30 min；在液氮面上方6 cm處平衡10 min，然后在液氮面上平衡5 min，最后投入液氮中。

1.2.5 不同稀釋比的樣品制備 經(jīng)清水激活鏡檢后，選擇精子活力好的精液與抗凍保護(hù)劑按1 ∶3、1 ∶5、1 ∶8、1 ∶10的體積比稀釋，混勻樣品后，以每管1 mL樣品量存放于凍存管內(nèi)。

1.2.6 冷凍精子活力檢測(cè) 精子在液氮中保存60 d后，將其從液氮中取出，于液氮口處平衡5 min后，再于37 ℃水浴中快速解凍直至融化，立即放入顯微鏡視野下，用清水激活后觀察運(yùn)動(dòng)力。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同體積分?jǐn)?shù)甲醇抗凍劑對(duì)保存效果的影響

在美洲鰣魚(yú)精液中加入3個(gè)不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇抗凍劑，在超低溫（-196 ℃）冷凍保存60 d，解凍后顯微鏡觀察表明，10%甲醇作為抗凍劑，保存效果最好，精子存活率達(dá)到80%；甲醇體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，精子存活率最低，保存效果最差（表1）。

2.2 凍前平衡時(shí)間對(duì)保存效果的影響

以魚(yú)用任氏液和10%甲醇組成抗凍保護(hù)劑，測(cè)定0、10、20、30 min平衡時(shí)間對(duì)美洲鰣魚(yú)精子存活率的影響。結(jié)果顯示，在平衡時(shí)間20 min時(shí)精子存活率最高（表2）。

2.3 不同精液稀釋比對(duì)保存效果的影響

用魚(yú)用任氏液作稀釋液、10%甲醇作抗凍保護(hù)劑，對(duì)用不同精液稀釋比保存的精子活力進(jìn)行測(cè)定，表3結(jié)果顯示精液按1 ∶3稀釋時(shí)，凍精存活率最高，達(dá)到80%。

3 討論與結(jié)論

目前精液超低溫冷凍保存的方法一般遵循的原則是慢凍速融，本試驗(yàn)的結(jié)果符合該原則。關(guān)于魚(yú)類精液保存稀釋液的配制，由于試驗(yàn)用魚(yú)種類的不同，稀釋液也有所差異。稀釋液的配制是魚(yú)類精液冷凍保存中關(guān)鍵的一步，稀釋液的適合與否直接影響到保存結(jié)果[6]。一般認(rèn)為稀釋液的成分在合適的范圍內(nèi)越簡(jiǎn)單越好，目前用于魚(yú)類精液超低溫冷凍保存的稀釋液配方多數(shù)都是借鑒家畜的精液超低溫保存配方或者憑經(jīng)驗(yàn)配制。魚(yú)用任氏液是被廣泛用于淡水魚(yú)類精子的稀釋液[7]，本研究選用了任氏液配方作稀釋液進(jìn)行冷凍保存，取得了較好的試驗(yàn)效果。不同的稀釋倍數(shù)對(duì)精子的保存效果不同，在3個(gè)不同的稀釋比試驗(yàn)中，以1 ∶3的稀釋比保存效果最好。在加抗凍保護(hù)劑之前，于4 ℃平衡20 min，既可以降低溫度速降帶來(lái)的損傷，又能使抗凍劑充分滲透。于海濤等認(rèn)為，平衡一段時(shí)間有利于抗凍劑更好地發(fā)揮作用，并且精子在冷凍之前代謝活動(dòng)降低，對(duì)低溫冷凍有一個(gè)逐步適應(yīng)的過(guò)程[8]。

由于不同種類魚(yú)的精子生理特性具有很大差異，確定最適的抗凍劑種類和濃度非常重要[9]。甲醇是較為常見(jiàn)的滲透性抗凍劑，應(yīng)用于少數(shù)水生生物精子冷凍也取得了較好的抗凍效果。由于抗凍劑的毒性會(huì)隨著其濃度升高而增強(qiáng)，因此所用抗凍劑濃度一般不會(huì)超過(guò)15%，本試驗(yàn)中抗凍劑甲醇的濃度最高為15%。Pan等研究發(fā)現(xiàn)，10%甲醇對(duì)黃顙魚(yú)冷凍保護(hù)效果最佳[10-11]。本研究選用3個(gè)不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇抗凍劑，結(jié)果表明10%甲醇抗凍劑對(duì)美洲鰣魚(yú)冷凍有較好的保護(hù)效果。

有關(guān)魚(yú)類精液的冷凍方法，目前文獻(xiàn)報(bào)道的主要有3種，即顆粒凍精法、安瓿瓶法、麥細(xì)管法。選用哪種方法受試驗(yàn)條件和技術(shù)手段的限制，最終結(jié)果也各有優(yōu)劣。曾經(jīng)有不少學(xué)者用顆粒凍精法冷凍精子并獲得較高的受精率，但是由于該方法需要特殊的解凍液，實(shí)用性不高。安瓿瓶體積較大，降溫難以均勻，且操作比較復(fù)雜。本試驗(yàn)采取的塑料凍存管冷凍法具有操作簡(jiǎn)便、安全的特點(diǎn)，易于廣泛推廣應(yīng)用。

通過(guò)精液冷凍保存技術(shù)，可將一些名貴、優(yōu)良的淡水魚(yú)類精液，尤其是將那些瀕危、珍稀物種的種質(zhì)資源進(jìn)行長(zhǎng)期有效的保存。通過(guò)建立相應(yīng)的魚(yú)類種質(zhì)資源庫(kù)，將這些物種的基因資源完全保存下來(lái)，可為淡水魚(yú)類種質(zhì)資源的保護(hù)開(kāi)辟一條新的途徑。

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