茶多酚對豬精液低溫保存的影響

彭夏云 陸媚　許春榮　劉德玉　李銘　胡傳活

摘要：為了尋找一種可較好保護(hù)精子的低溫保護(hù)劑，改善豬精液低溫保存方法，通過在改進(jìn)的豬精液低溫稀釋液中添加0、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL茶多酚，對比7 d內(nèi)4 ℃下低溫保存豬精子的活率、活力、畸形率、質(zhì)膜和頂體完整性等參數(shù)，探討茶多酚在豬精液低溫保存中應(yīng)用的效果。結(jié)果表明，在豬精液低溫保存后7 d，僅0.50、1.00 mg/mL 組5個質(zhì)量指標(biāo)均顯著好于對照組（P<0.05），其中1.00 mg/mL組效果最好?？傊?，在本試驗(yàn)條件下，適宜濃度的茶多酚可以明顯改善4 ℃低溫條件下豬精液的保存效果，其中最佳添加濃度是1.00 mg/mL。

關(guān)鍵詞：豬；精液；低溫保存；茶多酚；活力；畸形率；頂體完整性

中圖分類號：S828.3+4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0210-03

隨著我國養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展和種豬聯(lián)合育種工作的需要，豬的人工授精迅速普及，豬精液品質(zhì)的控制以及精液保存稀釋劑日趨成為豬人工授精技術(shù)的核心。然而，輸精后（尤其是用低溫冷凍后的精液）的受胎率卻很低，這與精子的受精能力有著重要的關(guān)聯(lián)[1]。精子作為一種復(fù)雜的終端細(xì)胞，必須具備一定條件才可以完成受精。從理論上說，當(dāng)精液溫度下降到4 ℃或更低時，精子代謝活動水平降低，營養(yǎng)物質(zhì)消耗減少，有利于延長精子的生命周期，達(dá)到長期保存的效果[2]；但是，在精液低溫保存過程中，由于精子質(zhì)膜組成的不同，豬精子對溫度的改變非常敏感，對低溫的耐受能力比其他家畜差，易發(fā)生冷休克，使得精子處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，產(chǎn)生大量的活性氧，氧化精子質(zhì)膜的不飽和脂肪酸導(dǎo)致膜脂流動性降低，最終導(dǎo)致精子細(xì)胞膜功能異常[3]、干擾精子代謝、損傷精子DNA[4]等，甚至誘發(fā)其凋亡[5]，這些局限在一定程度上限制了豬精液低溫保存技術(shù)的研究與應(yīng)用。茶多酚是一類存在于茶樹中的多羥基酚類化合物的總稱[6]，近年來，了解到茶多酚的抗氧化作用不僅對體外的油脂而且對體內(nèi)脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)、DNA 等具有比其他天然抗氧化劑如維生素C、維生素E和化學(xué)合成抗氧化劑更強(qiáng)的保護(hù)作用[7]，但是目前未見其活性成分在豬精液保存方面應(yīng)用的報道。本試驗(yàn)將不同濃度茶多酚添加到稀釋液中，研究其對豬精液低溫保存的影響，以期為豬精液低溫保存稀釋液配方的改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器 主要試劑：茶多酚（由上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)），考馬斯亮藍(lán)（由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)），葡萄糖、蔗糖（由國藥集團(tuán)制藥總廠生產(chǎn)），青霉素、慶大霉素、碘化丙啶（Sigma中國有限公司），Diff-Quik染液（由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)），卵黃（取自廣西南寧市富鳳農(nóng)牧有限公司生產(chǎn)的初產(chǎn)雞蛋），新鮮豬精液（由廣西科達(dá)畜禽改良有限公司提供）。

主要儀器設(shè)備：邁郎精子全自動分析系統(tǒng)、相差顯微鏡（由南寧松景天倫生物科技有限公司生產(chǎn)），電子冷暖箱（由北京福意聯(lián)電器有限公司生產(chǎn)），冰箱（由河南新飛電器有限公司生產(chǎn)），電熱恒溫水槽（由上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)），電子天平（由上海菁海儀器有限公司生產(chǎn)），恒溫載物臺（由江蘇省金壇市杰瑞爾電器有限公司生產(chǎn)）。

1.1.2 低溫稀釋液的配制 在徐振軍等報道的配方[8]基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)：蔗糖 4 g、葡萄糖 3 g、慶大霉素0.048 g、青霉素0.06 g、卵黃（7 000 g、15 ℃離心25 min，取上清液）20 mL，溶于80 mL雙蒸水中。

1.2 精液處理方法

1.2.1 精液采集 采用手握法采集精液，將預(yù)熱好的集精杯（35～37 ℃）用滅菌濾紙蓋好，收集中間段精液，邊采集邊過濾去除膠狀物。在37 ℃下用顯微鏡檢查常規(guī)品質(zhì)，精子活力在0.7以上、無異味、色澤為乳白色的精液，放入保溫瓶中于1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2.2 精液稀釋與平衡 精液帶回實(shí)驗(yàn)室后（室溫25 ℃左右），暗處靜置20 min，測量精液和稀釋液的溫度，確保二者的溫差為0.1～0.3 ℃。將含有各濃度茶多酚的低溫稀釋液（提前12 h配制好）按1 ∶1的比例緩慢加入到豬精液中，輕輕上下?lián)u晃，使精液與稀釋液充分接觸，室溫23～25 ℃下暗處靜置平衡0.5 h；然后將低溫稀釋液（溫度保持25 ℃左右）按1 ∶1的比例再次加入上述已混勻的液體中，使得豬精液與稀釋液的最終稀釋比為1 ∶3；用數(shù)層紗布包裹后放入電子冷暖箱中17 ℃下平衡3 h，再次包裹數(shù)層紗布放入冰箱中4 ℃下保存，每6 h輕輕搖動1次，防止精子沉淀死亡。

1.3 精子質(zhì)量評價

采用PI熒光染色法[9]檢測精子活率，計算機(jī)輔助精液分析儀（CASA）[9]檢測精子活力，Diff-Quik染色[10]檢測精子畸形率，考馬斯亮藍(lán)染色法[11]檢測精子頂體完整率，低滲腫脹法（HOST）[12]檢測質(zhì)膜完整率。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)按茶多酚在低溫稀釋液的濃度（0、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL）分為5組，7 d內(nèi)對精子的活率、活力、畸形率、彎尾率和頂體完整率進(jìn)行測定，試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel進(jìn)行前期處理，然后用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析和多重比較，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對低溫保存豬精子活率的影響

由表1可知，在4 ℃低溫條件下，0.50、1.00 mg/mL添加組7 d內(nèi)均可以提高豬精子活率，其中1.00 mg/mL添加組效果更好，與對照組相比差異顯著（P<0.05）；1.50 mg/mL添加組從第3天開始對精子活率有顯著提高的作用；高濃度組（2.00 mg/mL）僅在第3、第4天可以顯著提高精子活率，其余時間與對照組差異不顯著（P>0.05）。

2.2 茶多酚對低溫保存豬精子活力的影響

由表2可知，在4 ℃低溫條件下，添加茶多酚各試驗(yàn)組精子活力均高于對照組，但2.00 mg/mL添加組的活力在前4 d顯著高于對照組（P<0.05），第5天開始與對照組差異不顯著（P>0.05）；另外3組（0.50、1.00、1.50 mg/mL）7 d內(nèi)的活力與對照組相比差異均顯著（P<0.05）。其中，1.00 mg/mL 添加組效果最佳，在第3天和第5天至第7天顯著優(yōu)于對照組及各添加組（P<0.05）。

2.3 茶多酚對低溫保存豬精子畸形率的影響

由表3可知，在4 ℃低溫保存條件下，0.50、1.00 mg/mL添加組可顯著降低精子的畸形率（P<0.05）；1.50 mg/mL添加組的畸形率在保存的第3天至第5天顯著低于對照組（P<005）；高濃度添加組（2.00 mg/mL）的畸形率在7 d內(nèi)與對照組相比差異不顯著（P>0.05）。

2.4 茶多酚對低溫保存豬精子頂體完整性的影響

由表4可知，高濃度組（2.00 mg/mL）的精子頂體完整從第2天開始顯著高于對照組（P<0.05）；其余3組的頂體完整率在7 d內(nèi)均顯著高于對照組（P<0.05），其中0.50、1.00 mg/mL 濃度組效果較好，第6天時仍達(dá)50%以上。

2.5 茶多酚對低溫保存豬精子質(zhì)膜完整性的影響

由表5可知，添加茶多酚各試驗(yàn)組精子質(zhì)膜完整率均高于對照組，但2.00 mg/mL濃度組與對照組相比差異不顯著（P>0.05）；1.50 mg/mL濃度組從第3天開始顯著高于對照組（P<0.05）；0.50、1.00 mg/mL濃度組能顯著提高精子質(zhì)膜完整率（P<0.05），但這2組差異不顯著（P>0.05）。

3 結(jié)論與討論

精液在稀釋過程中暴露于空氣中，使得其氧氣濃度高于在生殖道內(nèi)的氧氣濃度，體外操作時光線和溫度會發(fā)生變化，低溫保存過程中會發(fā)生低溫打擊，這些外界因素都會使豬精子細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增加，從而引起氧化應(yīng)激損傷和脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致精子結(jié)構(gòu)和功能的損傷。本試驗(yàn)結(jié)果表明，向豬精液稀釋液中添加茶多酚，對豬精子4 ℃低溫保存起較好的保護(hù)作用，可明顯提高低溫保存下豬精子的運(yùn)動參數(shù)、頂體完整率以及質(zhì)膜完整率效果最好的為1.00 mg/mL濃度組。茶多酚對豬精子低溫保存有這樣的保護(hù)作用，其原因可能與它的抗氧化機(jī)制有關(guān)。茶多酚作為優(yōu)良的氫供體，向活潑自由基提供氫離子后形成的自由基通過共振雜化成穩(wěn)定的自由基；而提供的氫離子與活潑自由基結(jié)合后，使得活潑自由基失活，切斷其鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而延緩油脂中不飽和脂肪酸自動氧化成過氧化物的連鎖反應(yīng)，起到抗氧化作用。茶多酚的顯著抗氧化性在于還可以降低脂質(zhì)過氧化物和丙二醛的含量，從而降低氧自由基對精子細(xì)胞的損傷[13]。另外，茶多酚最主要的活性成分為兒茶素類，其中沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）活性最強(qiáng)，同時具有抗氧化和抗凋亡作用。有研究表明，EGCG具有對抗β-淀粉樣蛋白誘致海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡作用[14]，并對過氧化氫、一氧化氮和1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶等氧化應(yīng)激因素誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞和SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡模型具有抗凋亡作用[15-16]。EGCG抗細(xì)胞凋亡作用取決于其結(jié)構(gòu)中含有2個三酚基團(tuán)，該基團(tuán)是其抗氧化作用的主要活性部位，通過增強(qiáng)抗氧化酶的活性加速氧化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，同時阻止細(xì)胞氧化產(chǎn)物的大量生成，尤其是ROS的生成，減少對線粒體的氧化性損傷，而精子尾部節(jié)律性運(yùn)動的能量主要來自線粒體呼吸代謝產(chǎn)生的ATP，這可能是其抗細(xì)胞凋亡的主要作用機(jī)制[15-16]。茶多酚的強(qiáng)抗氧化性和抗凋亡作用不容小覷，雖然本試驗(yàn)結(jié)果也證明了它在豬精液低溫保存中的保護(hù)作用，但具體的更有說服力的機(jī)理和原因還有待于進(jìn)一步探索。

適宜濃度的茶多酚均可以明顯改善4 ℃低溫條件下豬精液的保存效果，其中1.0 mg/mL濃度組對精子在7 d內(nèi)的保存質(zhì)量均起到提高作用，效果較好。

參考文獻(xiàn)：

[1]Johnson L A，Weitze K F，F(xiàn)iser P，et al. Storage of boar semen[J]. Animal Reproduction Science，2000，62（1/2/3）：143-172.

[2]Bailey J L，Bilodeau J F，Cormier N. Semen cryopreservation in domestic animals：a damaging and capacitating phenomenon[J]. Journal of Andrology，2000，21（1）：1-7.

[3]Curry M R，Kleinhans F W，Watson P F. Measurement of the water permeability of the membranes of boar，ram，and rabbit spermatozoa using concentration-dependent self-quenching of an entrapped fluorophore[J]. Cryobiology，2000，41（2）：167-173.

[4]Harrison R A P，Ashworin P J C，Miller N G A.Bicarbonate/CO2，an effector of capacitation，induces a rapid and revensible change in the lipid architecture of boar sperm plasma membranes[J]. Molecular Reproduction and Development，1996，45：378-391.

[5]Henkel R，Kierspel E，Stalf T，et al. Effect of reactive oxygen species produced by spermatozoa and leukocytes on sperm functions in non-leukocytospermic patients[J]. Fertility and Sterility，2005，83（3）：635-642.

[6]趙愛云. 新型天然抗氧化劑茶多酚的研究進(jìn)展[J]. 中國食品添加劑，2005（5）：78-80，86.

[7]王彩華. 茶色素治療高血壓病高粘血癥的臨床觀察[J]. 實(shí)用中醫(yī)藥雜志，1998，14（1）：44-45.

[8]徐振軍，任 康，白桂芬，等. 帶精漿直接稀釋法探討豬精液低溫（4 ℃）保存的可行性[J]. 廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2006，25（增刊1）：23-30.

[9]張 婷. 四種糖類對豬精液冷凍保存效果的研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008：18-20.

[10]王彥芳，張 洲，寇 卉. Diff-Quik與改良巴氏染色法對精子形態(tài)染色效果比較[J]. 吉林醫(yī)學(xué)，2012，33（24）：5155-5156.

[11]陸海一，陸金春，胡毓安，等. 考馬斯亮藍(lán)染色法檢測人精子形態(tài)和頂體反應(yīng)[J]. 中華男科學(xué)，2002，8（3）：204-206.

[12]朱 躍，朱 杰. 低滲腫脹精子類型對精子活動率及男性生育能力的影響[J]. 安徽醫(yī)學(xué)，2011，32（10）：1695-1697.

[13]李 軍，林麗文，辛 勤，等. 綠茶多酚抗衰老作用研究[J]. 食品與藥品，2013（2）：106-109.

[14]Choi Y T，Jung C H，Lee S R，et al. The green tea polyphenol（—）-epigallocatechin gallate attenuates β-amyloid-induced neurotoxicity in cultured hippocampal neurons[J]. Life Sciences，2001，70（5）：603-614.

[15]Koh S H，Kim S H，Kwon H，et al. Epigallocatechin gallate protects nerve growth factor differentiated PC12 cells from oxidative-radical-stress-induced apoptosis through its effect on phosphoinositide 3-kinase/Akt and glycogen synthase kinase-3[J]. Brain Research： Molecular Brain Research，2003，118（1/2）：72-81.

[16]Guo S H，Bezard E，Zhao B L. Protective effect of green tea polyphenols on the SH-SY5Y cells against 6-OHDA induced apoptosis through ROS-NO pathway[J]. Free Radical Biology & Medicine，2005，39（5）：682-695.