水貂嗜水氣單胞菌的分離鑒定與藥敏試驗

秦緒偉 （齊魯動物保健品有限公司 山東 濟南 250100）

試驗研究

水貂嗜水氣單胞菌的分離鑒定與藥敏試驗

秦緒偉 （齊魯動物保健品有限公司 山東 濟南 250100）

本試驗從發(fā)病水貂分離到一株細(xì)菌，經(jīng)生化試驗、16srRNA基因序列測定最終確定為嗜水氣單胞菌，經(jīng)動物試驗確定有致病性，經(jīng)藥敏試驗選擇氧氟沙星作為理想的藥物，最終取得良好的治療效果。

水貂、嗜水氣單胞菌、分離、藥敏試驗、鑒定

山東臨沂某特種動物養(yǎng)殖場水貂發(fā)生以口鼻出血、急性死亡為主要臨床癥狀的病例，養(yǎng)殖戶已經(jīng)免疫過出血性肺炎疫苗，按照出血性肺炎使用藥物治療效果不佳，來實驗室檢測。水貂氣單胞菌病又稱為水貂出血性敗血癥，嗜水氣單胞菌隸屬于弧菌科氣單胞菌屬，在氣單胞菌屬中最為常見，廣泛存在于淡水、污水和土壤［1］，有些菌株對人和動物都有較強的致病性，有些菌株是環(huán)境和動物正常菌群的組成部分［2］。該養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖水貂約3000只，新進(jìn)一批淡水魚，飼喂5d后開始發(fā)病，開始每天死亡1～2只，發(fā)病7d時每天死亡約80只，主要表現(xiàn)為吃食多、營養(yǎng)狀況良好的死亡較多，急性死亡、口鼻出血，來不及治療。解剖可見口鼻出血、血凝不良、肝臟金黃色、肺臟嚴(yán)重出血、脾臟淤血、胃黏膜脫落、腎臟質(zhì)地較硬有出血點。經(jīng)化驗確診為水貂患致病性嗜水氣單胞菌。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗菌株 來自于山東臨沂一水貂養(yǎng)殖場水貂病料尸體。解剖后從肝臟、肺臟、心血分離一株細(xì)菌。

1.1.2其他材料 營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂、氣單胞菌瓊脂培養(yǎng)基等購自青島海博生物技術(shù)有限公司；微量生化試劑管購自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑公司；PCR試劑購自大連寶生物工程有限公司；其他實驗室常規(guī)試劑。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌的分離培養(yǎng)［3］對發(fā)病水貂進(jìn)行解剖，無菌條件下取肝臟、肺臟、心血分菌，接種于血清營養(yǎng)瓊脂，在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，培養(yǎng)出的細(xì)菌挑取單個菌落進(jìn)行純化，同時接種麥康凱瓊脂、SS瓊脂、兔血營養(yǎng)瓊脂、氣單胞菌鑒別瓊脂、馬丁肉湯，觀察菌落生長情況和菌落形態(tài)。

1.2.2細(xì)菌的16S rRNA分子生物學(xué)鑒定 無菌挑取平板

上的菌落加入到1ml無菌水中，震蕩混勻后沸水浴7min，冰浴5min，離心上清作為基因擴增的模板，設(shè)計引物：F1-5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，R1-5'ACG GCT ACC TTG TTG TTA CGA CTT-3'，PCR反應(yīng)體系（50μl）：10*PCR Buffer（含MgCl215mmol/L，KCl500mmol/ L）5μl，2.5mmol/L dNTP 4μl，引物（20umol/L）各1μl，模板2μl，ddH2O36.8μl，Taq酶（5U/μl）0.25μl。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1.5min，30個循環(huán)；72℃ 10min。取PCR產(chǎn)物5μl用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物送交上?；驕y序公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提交Genbank進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，判定細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育地位，以97%相似性為界限判定為何種菌。

1.2.3細(xì)菌的生化試驗［4］血清平板上挑取單個菌落，接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，分別取0.2ml接種于乳糖、葡萄糖、水楊苷、甘露醇、木糖、蔗糖、肌醇、山梨醇等微量生化反應(yīng)試管，24h后觀察生化反應(yīng)結(jié)果。

1.2.4細(xì)菌的藥敏試驗 使用藥敏紙片法對分離的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗，用接種環(huán)挑取單個菌落涂布于血清營養(yǎng)瓊脂平板，將藥敏片貼于平板，37℃恒溫箱培養(yǎng)24h后量取藥敏片抑菌圈的直徑，判定該菌的耐藥性。

1.2.5細(xì)菌的毒力試驗 在營養(yǎng)瓊脂平板無菌取單個菌落，接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，培養(yǎng)后計數(shù)，將細(xì)菌原液10倍稀釋液、100倍稀釋液、1000倍稀釋液分別腹腔注射18～22g小白鼠5只，0.5ml/只，注射后觀察7d，對照組3只。對死亡的小白鼠解剖進(jìn)行細(xì)菌分離。將分離細(xì)菌取最大稀釋度再進(jìn)行動物回歸試驗。

2　結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

無菌分離病死水貂的心血、肝臟、肺臟，血清平板上37℃溫箱24h培養(yǎng)可見中等大小圓形、稍微隆起、光滑濕潤、半透明、灰白色菌落；挑取血清平板上單個菌落，轉(zhuǎn)接后在麥康凱瓊脂上37℃溫箱24h培養(yǎng)可見中等大小無色圓形、光滑、隆起的菌落；SS瓊脂上37℃溫箱24h培養(yǎng)可見中等大小無色圓形、光滑、隆起的菌落；血瓊脂平板上37℃溫箱24h培養(yǎng)可見中等大小無色圓形、光滑、隆起的菌落，有明顯的β溶血環(huán)；氣單胞菌鑒別瓊脂培養(yǎng)基平板上37℃溫箱24h培養(yǎng)可見中等大小圓形、光滑、隆起的紅色菌落；馬丁肉湯震蕩培養(yǎng)24h可見液體混濁，圖片鏡檢可見革蘭氏染色陰性，兩端鈍圓桿菌，形態(tài)較小，有莢膜無芽孢。

2.2細(xì)菌16S rRNA的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

根據(jù)上海測序公司返回的測序結(jié)果，采用Bioedit軟件參照正反向序列圖譜對序列進(jìn)行人工校對，然后輸入Genbank用Blastn軟件進(jìn)行相似性比較，最后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，與氣單胞菌相似性為99.7%，確定為氣單胞菌。

2.3細(xì)菌的生化結(jié)果

將分離菌進(jìn)行了微量生化試驗，試驗結(jié)果表明該菌能發(fā)酵蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖，氧化酶試驗陽性，不發(fā)酵乳糖、鼠李糖、肌醇和山梨醇，硝酸鹽還原試驗、七葉苷、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶試驗陽性，鳥氨酸脫羧酶試驗陰性，確定為嗜水氣單胞菌，結(jié)果見表1。

表1　分離菌生化鑒定結(jié)果

2.4細(xì)菌的藥敏試驗結(jié)果

將嗜水氣單胞菌涂布于血清營養(yǎng)瓊脂平板，把標(biāo)記好的藥敏片貼于血清平板，最終根據(jù)抑菌圈的大小判定藥物的敏感程度，其中頭孢喹肟、頭孢噻肟、頭孢噻呋鈉高敏敏感，左氧氟沙星、丁胺卡那、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、恩諾沙星中度敏感，強力霉素、阿奇霉素、粘桿菌素、氟苯尼考低度敏感，阿莫西林、氨芐西林、壯觀霉素、替米考星不敏感，最終選擇左氧氟沙星作為敏感藥物拌料、頭孢喹肟注射作為治療。藥敏結(jié)果見表2。

表2　分離菌的藥敏結(jié)果 （mm）

2.5毒力試驗結(jié)果

從血清瓊脂平板無菌挑取單個菌落接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h后進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，計數(shù)為40億/ml，將細(xì)菌原液10倍稀釋液、100倍稀釋液、1000倍稀釋液分別腹腔注射小白鼠5只，0.5ml/只，注射原液10倍稀釋液、100倍稀釋液組第2天全部死亡，1000倍稀釋液觀察7d未見死亡，可見2000萬細(xì)菌對小白鼠較強毒力，200萬細(xì)菌對小白鼠無毒力，分離菌屬于中強毒。對死亡小白鼠解剖，心血、肝臟細(xì)菌分離，血清平板分離到中等大小圓形、隆起、光滑濕潤、半透明、灰白色較純的菌落，經(jīng)鑒定為分離的嗜水氣單胞菌，將分離菌接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h后100倍稀釋，將稀釋液腹腔注射小白鼠5只，0.5ml/只，第2天全部死亡，對照組觀察7d，健活。

3　討論

3.1水貂嗜水氣單胞菌的分離與鑒定

該病例發(fā)生在9月中旬，正值天氣炎熱，水貂換毛期間，水貂機體抵抗力較弱，死亡主要為營養(yǎng)狀況良好體況較胖的水貂。主要癥狀為急性死亡、口鼻出血，少量減食拒食尖叫痙攣后死亡。畜主在7月份已經(jīng)免疫過出血性肺炎疫苗，按照水貂出血性肺炎投藥治療，采取全群空氣環(huán)境消毒，投服抗生素治療7天效果不佳，死亡增加。來本處解剖可見口鼻出血，血凝不良，氣管環(huán)內(nèi)有血液，肺臟嚴(yán)重出血淤血呈黑色腫脹，肝臟腫大呈現(xiàn)嚴(yán)重的土黃色、質(zhì)脆易碎、有出血點，脾臟腫大淤血呈現(xiàn)大量黑色淤血斑，腸系膜淋巴結(jié)腫大灰白色壞死，胃內(nèi)大量食物，胃黏膜脫落。臨床解剖癥狀與綠膿桿菌引起的出血性肺炎相似，經(jīng)實驗室分離鑒定為嗜水氣單胞菌。

3.2水貂嗜水氣單胞菌的鑒別診斷

此次水貂發(fā)病初期養(yǎng)殖戶自行診斷為綠膿桿菌感染引起的水貂出血性肺炎，采取環(huán)境消毒與抗生素治療效果不佳，經(jīng)調(diào)查養(yǎng)殖戶兩月前注射過肺炎二價疫苗。水貂嗜水氣單胞菌和綠膿桿菌引起的肺炎臨床上都是急性死亡、口鼻出血，解剖都是肺臟嚴(yán)重出血，臨床通過臨床癥狀和解剖癥狀很難與綠膿桿菌引起的出血性肺炎區(qū)別，養(yǎng)殖戶注射過綠膿桿菌二價疫苗，通過環(huán)境消毒和使用治療綠膿桿菌的抗生素?zé)o效，可以初步排除綠膿桿菌病，確診需要細(xì)菌分離鑒定，通過細(xì)菌分離，分離菌進(jìn)行綠膿桿菌PCR陰性，進(jìn)行分離菌16S rRNA分子生物學(xué)基因測序確定為氣單胞菌，根據(jù)一系列生化試驗確定為嗜水氣單胞菌。

3.3水貂嗜水氣單胞菌病的診療

停止使用淡水魚，改用新鮮的海雜魚，清洗水罐，飲水投聚維酮碘消毒，根據(jù)藥敏試驗選擇氧氟沙星拌料，15mg/只，使用后3d見效，發(fā)病死亡減少，5d后控制疫情，不吃食的注射頭孢喹肟，2mg/kg體重肌肉注射，另外添加黃芪多糖、紫錐菊、電解多維等添加劑提高免疫力，按照療程治療取得良好的效果。水貂的嗜水氣單胞菌報道的比較少，臨床發(fā)病癥狀、解剖癥狀與綠膿桿菌、巴氏桿菌等引起的出血性肺炎相似，一般不作為發(fā)病診斷致病的主因，在臨床上也不容易確診，一般發(fā)現(xiàn)急性死亡口鼻出血首先懷疑是巴氏桿菌或者綠膿桿菌，養(yǎng)殖戶按照綠膿桿菌選擇敏感的藥物和環(huán)境消毒效果不佳，養(yǎng)殖戶也注射過綠膿桿菌二價疫苗，通過試驗最終確診為水貂患嗜水氣單胞菌病，根據(jù)其新購進(jìn)海雜魚使用5d并從其中分離到嗜水氣單胞菌確定是由使用飼料魚引起的水貂嗜水氣單胞菌病，采取更換飼料魚、抗生素治療的方案，很好地制止了死亡，減少了損失。

3.4水貂嗜水氣單胞菌病的預(yù)防

本病沒有疫苗免疫，預(yù)防本病主要是做好基本衛(wèi)生防疫工作外，主要是防止飼料魚的感染，不使用變質(zhì)魚，久存的魚及時清理。嗜水氣單胞菌主要來源于魚類，此次水貂發(fā)病就是因為使用了來源不明的飼料魚，使用5d后開始發(fā)病，預(yù)防本病主要是禁止使用來源不明的、有異味的變質(zhì)飼料魚。一旦發(fā)生出血性肺炎按照綠膿桿菌治療無效或已經(jīng)注射過綠膿桿菌疫苗，可以考慮是嗜水氣單胞菌。若診斷為嗜水氣單胞菌果斷采取更換飼料，使用敏感抗生素治療。

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［2］ 錢愛東. 獸醫(yī)全攻略毛皮動物疾?。跰］. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社，2009， 297-300.

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S852.61

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1007-1733（2015）06-0001-03