重組豬α干擾素的聚乙二醇修飾研究

李增++趙俊++王明麗

摘要：采用分子量為20 kD單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯（mPEG-SC）修飾重組豬α干擾素，初步研究了修飾反應(yīng)條件及分離純化工藝。結(jié)果表明，單修飾PEG-IFNα的轉(zhuǎn)化率達(dá)到65%，單修飾產(chǎn)品純度達(dá)到97%。由于修飾產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量和不均一性的增加，導(dǎo)致其體外杭病毒活性降低，抗病毒活性保留達(dá)到未修飾重組豬α干擾素的29%，仍然具有良好的抗病毒作用。

關(guān)鍵詞：聚乙二醇；重組豬α干擾素；修飾

中圖分類號(hào)：S828 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2015）06-0005-02

PEG（聚乙二醇）是一種中性、水溶性、無(wú)毒性的聚合物。在水溶液中長(zhǎng)鏈的PEG分子，具有高水合性，可以附著到其他分子和表面上，提供了一個(gè)生物相溶的、保護(hù)性外殼。這種保護(hù)性外殼降低了生物系統(tǒng)對(duì)這些材料的清除能力，極大的降低了蛋白質(zhì)、細(xì)胞和細(xì)菌的吸附，降低了腎臟的清除率。PEG在水和許多有機(jī)溶劑中可溶，在水溶液中它和其他聚合物如葡聚糖一起可形成雙相系統(tǒng)。雙功能PEG的水溶性、無(wú)毒性、高柔性和特征明確的化學(xué)特性，使它成為理想的修飾蛋白類產(chǎn)品的交聯(lián)材料[1]。PEG與干擾素的偶聯(lián)已廣泛應(yīng)用于用于臨床。如先靈葆雅公司開(kāi)發(fā)的聚乙二醇化人干擾素α-2β（商品名，佩樂(lè)能，PegIntron）；羅氏公司開(kāi)發(fā)的聚乙二醇化人干擾素α-2β（商品名，派羅先，PegasyS）等。已經(jīng)證實(shí)被偶聯(lián)后的干擾素，生物學(xué)活性大部分得以保留，同時(shí)免疫應(yīng)答極大地降低，血清半衰期也極大地得到了延長(zhǎng)。

動(dòng)物α型干擾素對(duì)畜禽病毒性疾病具有較好的防治效果。安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室采用基因工程技術(shù)克隆并表達(dá)了豬α型干擾素，并將實(shí)驗(yàn)室合格產(chǎn)品制成凍干粉針劑發(fā)送至安徽省多家養(yǎng)豬場(chǎng)進(jìn)行臨床試驗(yàn)。結(jié)果證明，該室研制的重組豬α干擾素能有效治療豬病毒性疾病。對(duì)治療豬病毒性腹瀉有效率為83.5%，治愈率為63.9%。在該項(xiàng)目的基礎(chǔ)上，對(duì)重組豬α干擾素進(jìn)行聚乙二醇化修飾，以獲得長(zhǎng)效制劑，從而延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)循環(huán)半衰期、減少體內(nèi)清除率，減少給藥次數(shù)、降低動(dòng)物的應(yīng)激性、增強(qiáng)療效、降低用藥成本。作為新型獸藥的開(kāi)發(fā)這一項(xiàng)目有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和應(yīng)用前景，同時(shí)具有較高的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

本研究采用分子量大、反應(yīng)條件溫和的20 kΔ單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯（μ∏EΓ-∑X）修飾劑對(duì)重組豬α干擾素進(jìn)行了修飾（圖1），并通過(guò)控制反應(yīng)條件，期望獲得半衰期更長(zhǎng)、更穩(wěn)定，且體外活性保留較高的∏E?；亟M豬α干擾素產(chǎn)物。且對(duì)該單修飾產(chǎn)物進(jìn)行了純度、體外抗病毒活性進(jìn)行了檢測(cè)，為進(jìn)一步考察其藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

原料：?jiǎn)渭籽趸垡叶肩牾啺诽妓狨ィ╩PEG-SC），重組豬α干擾素。

儀器：Amersham Pharmacia公司的AKT A Explorer 色譜系統(tǒng)；北京六一儀器廠的DYY-Ⅲ -4穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀。

試劑：牛血清白蛋白；甲叉丙烯酰胺； 丙烯酰胺、SDS；考馬斯亮藍(lán)R250； RRMI 1640培養(yǎng)基；小牛血清； 其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 聚乙二醇-重組豬α干擾素的制備與純化 干擾素用5 mmol/L pH3.0～5.0的磷酸二氫鉀緩沖液稀釋到0.1 mg/mL；加入計(jì)算量的干擾素，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到8.0，按干擾素：mPEG為1∶20的物質(zhì)的量加入1/4量的mPEG-SC，在0～4 ℃條件下反應(yīng)，隨后每間隔2 h加入1/4量的mPEG-SC，加入完畢后繼續(xù)反應(yīng)4 h，加入0.75 mol/L的甘氨酸1 mL終止反應(yīng)；隨后將上述反應(yīng)液用5倍量體積、濃度為50 mmol/L pH 7.2的醋酸鈉緩沖液稀釋，然后上Superdex 75 Highload制備型凝膠色譜柱（26 mm×600 mm， 22～24μm），以5倍體積pH 7.2的醋酸鈉緩沖液洗柱后，用含0.5 mol/L NaCl的醋酸鈉緩沖液洗脫，收集含PEG-干擾素的洗脫液，濃縮，SDS-PAGE電泳檢測(cè)。用Superdex 200對(duì)“（1）”中得到PEG化干擾素進(jìn)一步純化，洗脫液為pH 7.2的醋酸鈉緩沖液（含0.2 mol/L NaCl），用波長(zhǎng)為280 nm的紫外吸收檢測(cè)，收集含PEG-干擾素的洗脫液，濃縮。

1.2.2 SDS-PAGE電泳法對(duì)產(chǎn)物的檢測(cè) 對(duì)濃縮的各洗脫峰采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)，分離膠10%，濃縮膠5%。電泳結(jié)束后，將膠體固定（固定液：30%甲醇、5%乙酸）室溫?fù)u動(dòng)染色1 h（染色液：0.05%考馬斯亮藍(lán)、30%甲醇、5%乙酸）；最后將膠體移入脫色液（脫色液：1%戊二醛、30%甲醇、5%乙酸）中室溫?fù)u動(dòng)浸泡直至條帶清晰為止。

1.2.3 蛋白濃度的測(cè)定 以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，按Lowry法[3]測(cè)定濃縮后的蛋白濃度。

1.2.4 抗病毒活性的測(cè)定 采用WISH-VSV系統(tǒng)檢測(cè)干擾素的抗病毒活性[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚乙二醇-重組豬α干擾素的制備與純化

豬α干擾素的等電點(diǎn)在6.2左右，經(jīng)聚乙二醇修飾后，等電點(diǎn)有所降低，因此可采用離子交換層析的方法對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。結(jié)果如圖2所示，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明，修飾后產(chǎn)物分離組分（聚乙二醇-重組豬α干擾素）呈單一條帶，純度能夠達(dá)到97%。對(duì)條帶3反應(yīng)原液各組分經(jīng)光密度計(jì)算可知反應(yīng)修飾率能夠達(dá)到65%。

2.2 聚乙二醇-重組豬α干擾素抗病毒活性

對(duì)WISH細(xì)胞用不同劑量的修飾干擾素進(jìn)行處理，24 h后吸棄，再分別接種100 TCID50的VSV病毒。結(jié)果表明，聚乙二醇修飾后的重組豬α干擾素能夠明顯抑制VSV引起的細(xì)胞病變，通過(guò)效價(jià)測(cè)定（表1），所得的單修飾產(chǎn)物活性保留達(dá)到了29%。

3 討論

蛋白質(zhì)分子中的氧基有較高的親核反應(yīng)活性，而含有氨基的氨基酸主要有Lys和氮末端的氨基，對(duì)大部分蛋白來(lái)說(shuō)，通常賴氨酸含量比較高，因而賴氨酸的氨基是最易被PEG修飾的位點(diǎn)[5]。?；疨EG里包括經(jīng)常使用的mPEG-SC、mPEG-SS。其中，自從90年代初開(kāi)始開(kāi)發(fā)mPEG-SC以來(lái)，由于其與蛋白反應(yīng)時(shí)條件溫和，應(yīng)用的最多。

本研究采用分子量為20 000 的單mPEG-SC對(duì)重組豬α干擾素進(jìn)行了修飾。干擾素與干擾素修飾產(chǎn)物之間的主要差別之一是分子量的差異，因此本實(shí)驗(yàn)采用凝膠過(guò)濾色譜分離純化聚乙二醇修飾重組豬α干擾素。這種分離模式是已經(jīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，工藝成熟。利用該分離條件，我們成功的純化獲得聚乙二醇修飾重組豬α干擾素。此分離純化模式相對(duì)比較穩(wěn)定，回收率較為理想，一方面滿足了后續(xù)聚乙二醇修飾重組豬α干擾素性質(zhì)研究的需要，另一方面為它走向工業(yè)生產(chǎn)進(jìn)行嘗試，希望能為聚乙二醇修飾重組豬α干擾素產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)提供參考。抗病毒活性研究所得的修飾產(chǎn)品中IFN體外抗病毒活性隨著修飾后相對(duì)分子質(zhì)量的增加而降低，但活性保留達(dá)到了29%，仍然具有良好的抗病毒活性。

在本研究中，實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件溫和可控，對(duì)氮端修飾率高，分離純化工藝簡(jiǎn)單，收率高，可獲得高純度高均一性的樣品，確定了定點(diǎn)修飾干擾素的先導(dǎo)化合物，為后續(xù)開(kāi)發(fā)研究工作奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] PASUT G，VERONESE F M.State of the art in PEGylation： The great versatility achieved after forty years of research [J]. J Control Release，2012，161（2）：461-472.

[2] 趙 俊，張俊玲，李 增，等. 重組豬干擾素α1凍干粉針劑對(duì)豬的安全性試驗(yàn)研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2014（1）： 195-198.

[3] 閆 萍，楊 琦，王惠珍，等. 改良Lowry法和Bradford法測(cè)定蚯蚓提取物中蛋白質(zhì)含量的比較[J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006 （1）：9-11.

[4] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.中國(guó)生物制品規(guī)程. 一部[M]. 北京：中國(guó)人口出版社，1995. 268-269.

[5] 楊 旭，貢 濟(jì). 宇蛋白多肽類藥物聚乙二醇化修飾研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2012，31（19）：16-20.