DNA條形碼技術(shù)在雙翅目昆蟲中的應(yīng)用

閆嬌，姜麗，郭琴，王新華，閆春財

（1.天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；2.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300071）

DNA條形碼技術(shù)在雙翅目昆蟲中的應(yīng)用

閆嬌1，姜麗1，郭琴1，王新華2，閆春財1

（1.天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；2.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300071）

雙翅目昆蟲為完全變態(tài)發(fā)育，多個物種幼蟲和蛹形態(tài)相似、同一物種不同發(fā)育階段數(shù)據(jù)缺乏等問題都為雙翅目昆蟲的物種鑒定帶來困擾.DNA條形碼技術(shù)的有效性已被證實，廣泛應(yīng)用于分類學(xué)等多個領(lǐng)域.本文概述了DNA條形碼技術(shù)在雙翅目昆蟲中的應(yīng)用以及對該技術(shù)和方法提出的改進(jìn).

DNA條形碼；線粒體COI基因；雙翅目

雙翅目是昆蟲綱中僅次于鞘翅目、鱗翅目、膜翅目的第4大目，包括蠅、蚋、蚊、蠓等，物種豐富，分布廣泛.雙翅目昆蟲會引發(fā)或傳播人類某些重大疾病，如馴鹿皮蠅（Hypoderma tarandi）可造成眼內(nèi)蠅蛆病[1]；蚊子吸人畜血液，是蟲媒病傳播過程中重要的媒介生物[2].雙翅目昆蟲對農(nóng)林畜牧業(yè)也有重要影響，如南美斑潛蠅（Liriomyza huidobrensis）是對蔬菜和園藝作物造成重大損失的害蟲[3]；蕈蚊科昆蟲能為植物完成授粉作用[4]；Lixadmontia franki Wood&Cave幼蟲（寄蠅科）寄生在象鼻蟲（Metamasius callizona）體內(nèi)，是噬咬鳳梨科植物的入侵象鼻蟲害蟲的重要天敵，可作為害蟲生物控制的調(diào)節(jié)者[5].有些雙翅目昆蟲可以作為水體污染的指示生物，如搖蚊科幼蟲的生態(tài)需求和生活習(xí)性因種屬的不同而存在差異，對環(huán)境因子敏感性也不同，是水環(huán)境監(jiān)測的優(yōu)良指示生物[6].可見，雙翅目昆蟲與人類生活息息相關(guān)，具有重要的研究價值.

DNA條形碼技術(shù)自2003年提出以來發(fā)展迅速，被廣泛應(yīng)用于動植物的分類鑒定[7-14].同傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類鑒定相比，DNA條形碼技術(shù)的優(yōu)勢在于其不受實驗對象的雌雄和發(fā)育階段的限制，不受表型可塑性和遺傳可變性的影響，對鑒定者本身也沒有嚴(yán)格的專業(yè)背景要求[15].在動物分類學(xué)研究方面選用的基因序列，首選線粒體基因（COI、COⅡ），其次是核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因（ITS-1，ITS-2）、5.8S rDNA、EF-1α基因、白眼基因（White gene）和CAD基因等.在雙翅目昆蟲的研究中，DNA條形碼技術(shù)主要應(yīng)用于物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，本文從以下5方面對其進(jìn)行綜述.

1 DNA條形碼技術(shù)在物種鑒定中的應(yīng)用

傳統(tǒng)分類學(xué)方法的局限主要有3方面：①表型可塑性和遺傳多樣性會導(dǎo)致物種的錯誤鑒定；②對于變態(tài)發(fā)育的雙翅目昆蟲來說，形態(tài)學(xué)鑒定的特征大多只針對雄成蟲，而雌成蟲和幼蟲等發(fā)育階段因形態(tài)相似難以鑒定到種；③分類學(xué)專業(yè)術(shù)語以及特征的判斷需要專業(yè)的知識背景.而以DNA序列為基礎(chǔ)的分子分類可以為分類學(xué)帶來進(jìn)一步的發(fā)展，如鑒定物種、發(fā)現(xiàn)新種和隱存種等.目前，DNA條形碼技術(shù)在蠓科、蚋科、實蠅科、搖蚊科、蚊科等多個雙翅目類群中的鑒定均有報道[16-29].

Meeyen等[16]利用COI基因?qū)苯穼嵪墸˙actrocera latifrons，實蠅科）進(jìn)行了分子分類鑒定，鑒定成功率為100%，證實了COI基因作為DNA條形碼技術(shù)分子標(biāo)記的有效性.朱振華等[17]選用mtDNA CytB基因，以果實蠅屬的桔小實蠅（Bactrocera dorsalis）、瓜實蠅（B. cucurbitae）、南瓜實蠅（B.tau）、番石榴實蠅（B. correcta）、具條實蠅（B.scutellata）、黑漆實蠅（B. scutellaris）等6種實蠅為實驗對象，經(jīng)分析得出，mt DNA CytB基因片段有30個位點穩(wěn)定性較高，種內(nèi)遺傳距離為0～0.019，種間遺傳距離為0.059 24～0.191 33，種間差異大于種內(nèi)差異，因此mtDNA CytB基因可作為這6種實蠅分子鑒別的依據(jù).Gao等[18]利用條形碼技術(shù)，選用COI基因，鑒定出云南地區(qū)果蠅科Luzonimyia屬和Pararhinoleucophenga屬各2個果蠅新種，An等[19]也鑒定出云南地區(qū)果蠅科Phortica屬Ashima亞屬的3個新種.臺灣地區(qū)冠果蠅屬（Stegana Meigen）的種類在形態(tài)分類中數(shù)據(jù)欠缺，Zhang等[20]利用COI基因（568～708 bp），結(jié)合形態(tài)觀察，將其鑒定至種，為今后冠果蠅屬的物種鑒定提供了分子依據(jù)和形態(tài)學(xué)依據(jù).Guo等[21]同時采用COI基因（700 bp）和period基因（678 bp）鑒定麻蠅科（Sarcophagidae）物種，結(jié)果表明，同時選用線粒體COI基因和核基因period基因時，物種鑒定會更準(zhǔn)確.

Nielsen等[22]利用COI基因片段和形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了蠓科（Ceratopogonidae）庫蠓亞屬（subgenus Culicoides）的3個新種.Stur等[23]將條形碼技術(shù)和形態(tài)學(xué)方法相結(jié)合，選用COI序列對挪威芬馬克地區(qū)的蠓科9屬54種223個樣本進(jìn)行研究的結(jié)果表明，除3個形態(tài)種含有多個條形碼索引號（Barcode Index Numbers，BINs），可能存在隱存種之外，其他物種的DNA條形碼數(shù)據(jù)與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，表明COI基因在蠓科物種鑒定中的有效性.Nielsen等[24]用ITS-1序列對蠓科（Ceratopogonidae）庫蠓屬（Culicoides）進(jìn)行物種鑒定，表明ITS-1基因在蠓科物種鑒定中的有效性.Renaud等[25]選用蠅科（Muscidae）25屬160種1 114個樣本，擴(kuò)增COI序列，構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，為今后鑒定蠅科物種提供依據(jù).以往根據(jù)形態(tài)學(xué)特征很難將黑蠅的幼蟲鑒定到種，Pramual等[26]將泰國地區(qū)黑蠅未知幼蟲與已知成蟲COI基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示未知幼蟲為Simulium chaliowae和S.bullatum，這表明條形碼技術(shù)能將黑蠅幼蟲與成蟲階段相匹配，從而為幼蟲的物種鑒定提供依據(jù).赫坎按蚊種團(tuán)（Hyrcanusgroup）中物種關(guān)系密切且廣泛分布于東洋區(qū)和古北區(qū)，Ma等[27]利用ITS-2序列對其進(jìn)行物種鑒定，實驗擴(kuò)增ITS-2片段長度為436～469 bp，種內(nèi)差異0～0.4%，遠(yuǎn)小于種間差異，因此ITS-2可作為赫坎按蚊種團(tuán)物種鑒定的分子標(biāo)記.

Carew等[28]選用COI和CytB基因片段對搖蚊科昆蟲進(jìn)行物種鑒定，結(jié)果顯示COI基因（395 bp）平均種內(nèi)核酸差異為0～4.2%，平均種間差異為8.7%～34.1%；CytB基因（343bp）平均種內(nèi)核酸差異為0～4.4%，平均種間差異為7.0%～34.1%，種間差異遠(yuǎn)高于種內(nèi)差異.COI和CytB基因片段均可有效鑒定搖蚊科物種，但COI基因鑒定成功率（96%）高于CytB基因鑒定成功率（83%），而同時選用COI和CytB基因時，鑒定成功率高達(dá)99%.搖蚊科物種豐富，但在評估物種豐富度時，由于雌蟲在形態(tài)上不易鑒定，研究的主體往往只是雄蟲.鑒于一些搖蚊物種是孤雌生殖，忽略雌蟲就可能造成評估不準(zhǔn)確，Ekrem等[29]利用DNA條形碼技術(shù)對采自挪威中部保護(hù)區(qū)的搖蚊雌雄成蟲進(jìn)行物種鑒定，并將同一物種的雌雄成蟲進(jìn)行匹配，77.6%的雌蟲可鑒定到種，其余雌蟲僅能鑒定到屬.結(jié)果表明，當(dāng)把雌蟲考慮在內(nèi)時，記錄種的數(shù)量增加了27%，使評估得到的物種豐富度數(shù)據(jù)更加真實.

2 DNA條形碼技術(shù)在系統(tǒng)發(fā)育分析中的應(yīng)用

DNA條形碼本身不能用于系統(tǒng)發(fā)育分析，但由于DNA條形碼獲得的基因序列具有物種差異性，因此可用來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.Sari等[30]用COI基因（653 bp）對搖蚊科各亞科（26屬70種）進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，最大似然法（ML）分析顯示，除長足搖蚊亞科（Tanypodinae）以外，其他亞科均為單系；搖蚊亞科（Chironominae）與直突搖蚊亞科（Orthocladiinae）為姐妹群.在搖蚊族（Chironomini）中，除多足搖蚊屬（Polypedilum）外，搖蚊屬（Chironomus）、隱搖蚊屬（Cryptochironomus）、內(nèi)搖蚊屬（Endochironomus）和間搖蚊屬（Paratendipes）均為單系.在長跗搖蚊族（Tanytarsini）中，擬長跗搖蚊屬（Paratanytarsus）和枝長跗搖蚊屬（Cladotanytarsus）為單系，長跗搖蚊屬（Tanytarsus）和小突搖蚊屬（Micropsectra）非單系.而無突搖蚊屬（Ablabesmyia Pentaneurini）在鄰接法（NJ）分析中為單系，在ML分析中為非單系.Wang等[31]選用28S rDNA序列中高變區(qū)D1序列（28S rDNA D1），以長足搖蚊亞科中（Tanypus punctipennis）和（Procladius choreus）為外群，用鄰接法和最大簡約法（MP）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對直突搖蚊亞科中12個代表性屬級階元進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)研究.結(jié)果表明，心突搖蚊屬（Cardiocladius）和真開氏搖蚊屬（Eukiefferiella）聚為一支，流環(huán)足搖蚊屬（Rheocricotopus）和刀突搖蚊屬（Psectrocladius）聚為一支.結(jié)果與基于形態(tài)學(xué)的系統(tǒng)發(fā)育分析一致.

Jiang等[32]選取73個果蠅種的1 426個個體，利用NJ法、BM法、BCM法和MD法對條形碼數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示種間平均距離為14.04%，種內(nèi)平均距離為0.81%.另外，果蠅復(fù)合體存在時，條形碼鑒定成功率下降，其中BM法和BCM法成功率為74.4%，MD法為84.8%.若將復(fù)合體作為單一類群可獲得較高成功率（BM 98.9%，BCM 98.5%，MD 97.5%）.從系統(tǒng)樹可看出，Bactrocera dorsalis復(fù)合體、B.tryoni復(fù)合體、B. mesomelas（Bezzi）、B.calumniata（Hardy）、B.cucurbitae和B.tau（Walker）中的大多數(shù)物種為并系，B.dorsalis復(fù)合體中的B.cognata（Hardy&Adachi）和B.trivialis（Drew）為多系類群，B.zonata復(fù)合體中的B.correcta（Bezzi）、B.tuberculata（Bezzi）、B.zonata（Saunders）和B. tau復(fù)合體中的B.bezziana（Hering）、B.tau互為單系類群.

Jamnongluk等[33]用COI序列探討果實蠅屬（Bactrocera）中4亞屬（Asiadacus、Bactrocera、Hemigymnodacus、Zeugodacus）的分子系統(tǒng)關(guān)系.分別用MP法和NJ法（Jukes-Cantor模型）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所得系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)非常相似.結(jié)果顯示所有序列明顯分為2支：Asiadacus、Hemigymnodacus和Zeugodacus聚為1支，Bactrocera單獨為1支.相比于Bactrocera而言，Asiadacus、Hemigymnodacus和Zeugodacus相互之間關(guān)系更密切.分子系統(tǒng)分析結(jié)果符合形態(tài)分類結(jié)果.Bourke等[34]用COI（638 bp）、ITS（432 bp）、白眼基因（716 bp）這3個基因片段，對Anopheles strodei亞群進(jìn)行鑒定并分析其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系.分別用貝葉斯法建樹，選用COI的53個片段，選用ITS的49個片段，選用白眼基因的57個片段，外群為A.kompi Edwards、A.lutzii Cruz和A.galvaoi Causey.COI基因鑒定成功率為92%，但不能鑒定出A.albertoi和A.strodei；ITS-2鑒定成功率為60%.使用多重位點COI-ITS-2時，鑒定成功率為100%.貝葉斯法分析顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹分為7支，與原有研究一致.

3 DNA條形碼技術(shù)在其他方面的應(yīng)用

3.1 DNA條形碼技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

蠅科、麗蠅科、麻蠅科和小家蠅科等均為雙翅目嗜尸性昆蟲，因此根據(jù)其生活特性，可用來推測兇殺案的案發(fā)時間與發(fā)生時間的間隔（the postmortem interval，PMI），為刑偵學(xué)提供線索.在法醫(yī)學(xué)中，測定尸體上不成熟期蠅類的發(fā)育齡期是估計PMI的關(guān)鍵. Sonet等[35]認(rèn)為，以DNA分析為基礎(chǔ)，利用COI序列對各個發(fā)育階段的蠅類進(jìn)行有效物種鑒定是十分必要的.Jordaens等[36]以麻蠅科麻蠅屬56種126個樣本為實驗對象，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)，共分析99種270個COI片段，結(jié)果表明迷你條形碼（127 bp）的成功率較低（80.7%～82.7%），但658 bp的COI序列和COI全長（1 535 bp）在嗜尸性昆蟲麻蠅屬鑒定中成功率高達(dá)98.2%～99.3%.Meiklejohn等[37]分析了澳大利亞麻蠅科16種85個樣本，結(jié)果顯示：種間差異為6.658%～8.983%，種內(nèi)差異為0～1.499%，條形碼間隔（gap）明顯，96.5%的標(biāo)本可成功鑒定到種，COI序列可作為澳大利亞麻蠅科分子鑒定的有效工具.Boehme等[38]用條形碼技術(shù)鑒定了蚤蠅科6種（Megaselia scalaris、M. giraudii、M.abdita、M.rufipes、Conicera tibialis、Puliciphoraborinquenensis）.對法醫(yī)學(xué)而言，麻蠅物種鑒定可能因不同地區(qū)環(huán)境及群落結(jié)構(gòu)的差異而導(dǎo)致錯誤鑒定.Guo等[39]在中國10個省市13個采樣位點采集到23個麻蠅樣本，采樣范圍東至山東臨沂（35°05′E，118°35′N），西北至新疆烏魯木齊（43°46′E，87°36′N），南至海南萬寧（18°80′E，110°39′N）.實驗選用COI基因（278 bp）和16S rDNA（289 bp）這2個基因片段，結(jié)果顯示所獲樣本為4個種，分別為Boerttcherisca peregrina、Helicophagellamelanura、Parasarcophaga albiceps和Parasarcophaga dux.系統(tǒng)樹中節(jié)點支持率高，表明COI和16SrDNA可對麻蠅進(jìn)行有效物種鑒定.

3.2 DNA條形碼技術(shù)在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用

Brabrand等[40]為了解黑蠅（Simulium truncatum）在挪威Agardselva河流域每年爆發(fā)的原因，利用DNA條形碼技術(shù)對采樣獲得的卵和幼蟲進(jìn)行物種鑒定，從而得出S.truncatum產(chǎn)卵和卵孵化的主要區(qū)域，同時將此物種卵的主要分布區(qū)域與S.venustum類群中其他物種區(qū)域相區(qū)分.通過對比該區(qū)域的環(huán)境因素，發(fā)現(xiàn)這些區(qū)域之間明顯沿著一條人工河渠分布，由此解釋了S.truncatum的爆發(fā)原因，這表明條形碼技術(shù)對水體環(huán)境的變化及監(jiān)測有重要意義.

生物入侵是環(huán)境多樣性和生態(tài)平衡的重要威脅[41].因此在進(jìn)出口的檢疫工作中，需要將未知物種（包括蛹、幼蟲、成蟲）迅速并有效鑒定，判斷其是否為入侵物種.由于在形態(tài)分類學(xué)鑒定中，蛹和幼蟲鑒別特征不明顯，給檢疫工作帶來困擾，而DNA條形碼技術(shù)可以解決這些難題.Uechi等[42]發(fā)現(xiàn)日本沖繩縣（Okinawa Prefecture）的2種植物（Pseuderanthemum laxiflorum、Jasminum sambac）和三重縣（Mie Prefecture）的1種植物（Dendrobium spp.）花蕾均被癭蚊感染，經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定發(fā)現(xiàn)Contariniamaculipennis為日本入侵物種，且在該地區(qū)為首次記錄.Hu等[43]利用COI基因（782 bp）對中國入侵物種瓜實蠅（Bactrocera cucurbitae Coquillett）進(jìn)行了分子研究，揭示中國沿岸7個地理種群的基因多樣性極低，在取樣范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)亞洲東南部的瓜實蠅實為1個世系.實蠅科昆蟲中包括一些重要的農(nóng)業(yè)害蟲，為給檢疫工作提供便利，Li等[44]基于DNA條形碼建立了TBIS網(wǎng)站（Tephritid Barcode Identification System），含實蠅科150種400個COI序列，后期將逐漸添加形態(tài)學(xué)特征描述以及圖片介紹、寄主和地理分布等具體內(nèi)容，以期成為檢疫技術(shù)的有力工具.綜上所述，DNA條形碼對物種鑒定的有效性可以為生物入侵的檢測與控制提供新的支持.

3.3 DNA條形碼技術(shù)在醫(yī)學(xué)和畜牧學(xué)中的應(yīng)用

在人畜傳染病中，蟲媒病較多.雙翅目昆蟲如蠓、蚋、蚊、虻類等吸食人畜血液，是細(xì)菌、病毒等病原生物得以傳播和擴(kuò)散的媒介.蚊子作為媒介引起的登革熱早已引起關(guān)注，但在巴基斯坦，鮮有人研究蚊類多樣性.由于種間形態(tài)差異較小，很難評估該地區(qū)的蚊類多樣性和分布.直到2014年，Ashfaq等[45]選用COI序列，在該地區(qū)成功分析1 684個樣本（成功率87%），其中致倦庫蚊（Culex quinquefasciatus）占61%，伊蚊屬（Aedes）種類占15%（A.albopictus和A.aegypti為優(yōu)勢種），瘧蚊屬（Anopheles）占6%.根據(jù)形態(tài)學(xué)特征可鑒定出21種，如將所得基因序列與生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)（Barcode of Life Data Systems，BOLD）及GenBank數(shù)據(jù)對比，可增加記錄11種，其種內(nèi)差異為0～2.4%，種間差異為2.3%～17.8%.

蠓科庫蠓屬（Culicoides）的一些種類是藍(lán)舌病病毒的中間媒介，在北歐地區(qū)曾引發(fā)大規(guī)模藍(lán)舌病.Lassen等[46]用COI序列對Culicoides的種類進(jìn)行分析，表明其種內(nèi)差異＜1%，COI序列可成為庫蠓屬的分子標(biāo)記. Lassen等[47]對庫蠓屬昆蟲的吸食血液進(jìn)行分子鑒定，表明庫蠓屬常見寄主為牛、狍、馬、野鴨及斑鳩等，其中牛占73.9%，斑鳩占18.3%，表明其在選擇寄主時具有偏向性.

4 DNA條形碼技術(shù)的改進(jìn)

獲取DNA條形碼數(shù)據(jù)的主要步驟為：提取總DNA；PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測，微量蛋白核酸儀檢測目標(biāo)片段的純度；將電泳所得片段進(jìn)行割膠回收純化，測序；最后將測序序列進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，包括登錄NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對，分析序列的堿基組成并計算簡約信息位點、保守位點、變異位點的個數(shù)以及替代顛換飽和度分析，可構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.提取總DNA時可采用傳統(tǒng)方法（如CTAB、NaCl、SDS法）和試劑盒法.

從標(biāo)本到DNA條形碼分子標(biāo)記的獲得耗時費力，Wong等[48]以搖蚊為實驗材料，省去DNA提取相關(guān)步驟，做直接PCR（directPCR），證明優(yōu)化后的成功率高達(dá)90%.實驗高成功率的關(guān)鍵在于選取組織的質(zhì)量、身體部位、所用引物和Taq酶類型等方面.特別指出取材對直接PCR的成功率有直接影響：取成蟲足進(jìn)行直接PCR的成功率（100%）要遠(yuǎn)高于整只取材（成蟲體長＞2.5mm時，成功率為0）.對其他無脊椎動物類群的研究中發(fā)現(xiàn)直接PCR技術(shù)并不適用于外骨骼加厚及外分泌腺過多的昆蟲.

實驗材料放置時間過久容易造成DNA降解，導(dǎo)致基因提取和PCR成功率下降，無法獲得目標(biāo)片段.因此對于保存已久的樣本，DNA條形碼技術(shù)無法體現(xiàn)其優(yōu)勢.Hernandez-Triana等[49]研究博物館內(nèi)保存已久（保存時間大于10 a）的蚋科樣本（2屬36種271個樣本）時，選用6個不同的引物對進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果從215個樣本中獲得了有效序列，如表1所示.該研究強(qiáng)調(diào)了當(dāng)實驗材料保存過久時必須選用合適的引物對組合才能得到目的片段.

表1 引物對的選用及成功率Tab.1 Primer pairsadopted to obtain shortbarcode sequencesand success rates

Kim等[50]認(rèn)為種間和種內(nèi)樣品量的不足以及類群間的突變可能會影響DNA條形碼間隙的解釋和分析，使用新的指標(biāo)則能夠迅速和準(zhǔn)確地評估DNA條形碼間隙.使用新指標(biāo)界定條形碼間隙時，能夠鑒定出隱存種.在韓國搖蚊數(shù)據(jù)庫里，Dicrotendipes pelochloris種間差距明顯（種間距離0.138，種內(nèi)距離0.050，條形碼間隙IndexBarcodeGap0.341），但Cricotopus tricinctus差異不明顯（種間距離0.010，種內(nèi)距離0.004，IndexBarcodeGap0.967），因此Kim等定義了DM值，該DM值為平均種間遺傳距離，依賴于目標(biāo)物種的遺傳變異和數(shù)據(jù)庫.DM-最小種間遺傳距離（DminInter）和DM-最大種內(nèi)遺傳距離（DmaxIntra）可以避免當(dāng)種內(nèi)變異為0時，DNA條形碼間隙被錯誤解釋.運用此概念，計算出IndexBarcodeGap和最佳臨界值IndexCutoff，檢測了7個昆蟲條形碼數(shù)據(jù)庫Profile 100 Insect Families、Ephe-meroptera of North America（EPCHU）、Trichoptera of Churchill 2002-2007、Chilean Smicridea、Caddisflies of New Zealand、Moths of Ontario和BOLD Chironomids的有效性，進(jìn)而鑒定出14個隱存種，結(jié)果如表2所示.

表2 利用新指標(biāo)鑒定出的隱存種Tab.2 Summary of COI genetic divergence to predict cryptic species in insect datasets

5 結(jié)語

DNA條形碼技術(shù)是一種能夠?qū)ξ锓N進(jìn)行快速、有效鑒定的工具，在動植物分類鑒定中具有重要作用，為分類學(xué)研究開辟了新途徑.DNA條形碼自提出以來備受關(guān)注，得到多個領(lǐng)域?qū)W者的支持.在昆蟲分類學(xué)研究中，DNA條形碼不受蟲態(tài)限制，對實驗對象形態(tài)完整性沒有要求（部分組織器官、血液等均可）；它操作簡便，可大批量同時進(jìn)行，大大簡化了繁重的物種鑒定工作.常用的分子標(biāo)記基因COI、COⅡ和ITS片段等可直接采用其通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，物種不同不需重新設(shè)計引物.隨著DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展，迷你條形碼、直接PCR、下一代測序技術(shù)等的提出與應(yīng)用均為這項技術(shù)添加了新的活力.DNA條形碼不僅能進(jìn)行物種鑒定，還能進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.在雙翅目昆蟲的應(yīng)用中，為進(jìn)化生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、畜牧學(xué)、法醫(yī)學(xué)、生態(tài)學(xué)、進(jìn)出口檢疫等的研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

然而在其廣泛應(yīng)用中，不足之處也逐漸顯現(xiàn)：①核基因組中線粒體假基因（NUMTs）的干擾，會導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性，可能對物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析造成錯誤解釋；②目前DNA條形碼對物種界定并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，普遍認(rèn)為種間差異大于2%或種間差異大于種內(nèi)差異10倍時即為不同種，但當(dāng)種間差異和種內(nèi)差異不明顯并出現(xiàn)重疊時，DNA條形碼便不能進(jìn)行有效鑒定；③采用不同基因作為分子標(biāo)記會影響物種鑒定的有效性以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建；④COI基因在鑒定動物物種時成果顯著，但其在植物中進(jìn)化速率較慢、變異少，因此COI基因不適用于植物的物種鑒定；⑤構(gòu)建系統(tǒng)樹采用的建樹方法不同時，可能反映的種間、屬間情況不一致[31]；⑥D(zhuǎn)NA條形碼不能有效鑒定一些較小類群[51]，不能客觀解釋一些類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[52]；⑦采用不同引物對獲得目標(biāo)片段的成功率可能有影響，采樣量大小也可能對結(jié)果有影響.

盡管DNA條形碼技術(shù)有不足之處，但不可否認(rèn)的是它在多個類群中均具有效性.DNA條形碼技術(shù)不可能完全取代形態(tài)學(xué)分類方法，它可以作為形態(tài)學(xué)鑒定的輔助工具，為傳統(tǒng)的物種鑒定提供分子依據(jù).也就是說，將形態(tài)學(xué)分類與分子分類相結(jié)合，會使物種鑒定結(jié)果更科學(xué)更準(zhǔn)確，這是分類學(xué)發(fā)展的方向.目前交叉學(xué)科的興起和發(fā)展為眾多領(lǐng)域帶來生機(jī)，DNA條形碼技術(shù)可結(jié)合生態(tài)學(xué)、系統(tǒng)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、動物行為學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、生物地理學(xué)等學(xué)科，利用學(xué)科互補(bǔ)開拓新的研究領(lǐng)域.

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（責(zé)任編校 紀(jì)翠榮）

Application of DNA barcoding in Dipteran insects

YAN Jiao1，JIANG Li1，GUOQin1，WANGXinhua2，YANChuncai1
（1a. College of Life Sciences，1b. Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China；2. College of Life Sciences，Nankai University，Tianjin 300071，China）

Dipteran insects have completemetamorphosis development.It′s hard to diagnose the sibling species due to the similarities in externalmorphology of larva and pupa among differentspeciesand the lack ofdata ofeach developmental stage for the same species.DNA barcoding has been proved to have significant efficiency in species identification in previous studiesand iswidely applied.This paper summarized the applications of DNA barcoding in Dipteran insects.Meanwhile，the improvementsof technology and approacheswere proposed aswell.

DNA barcoding；mitochondrial COI gene；Diptera

Q969

A

2015-02-20

國家自然科學(xué)基金資助項目（31101653，31272284）；天津市自然科學(xué)基金資助項目（14JCQNJC14600）；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金資助項目（20090608）；天津師范大學(xué)引進(jìn)人才基金資助項目（5RL104）；天津市優(yōu)秀青年教師資助計劃（2013）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助項目（2015031，201410065046）.

閆嬌（1990—），女，碩士研究生.

閆春財（1979—），男，副教授，主要從事昆蟲系統(tǒng)學(xué)方面的研究. .

1671-1114（2015）03-0066-07