黃瓜根際土壤細(xì)菌群落的16S rDNAPCR-DGGE分析

趙柏霞 閆建芳 劉 秋 于基成 趙秀香

（1大連市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，遼寧大連 116036；2沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110161；3大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600）

黃瓜枯萎病〔Fusarium oxysporum（Schl） f. sp.cucumerinum〕是黃瓜生產(chǎn)上的一種頑固土傳病害，是目前造成我國(guó)瓜類(lèi)生產(chǎn)上大面積減產(chǎn)的主要原因之一，是黃瓜病害中最為嚴(yán)重、造成經(jīng)濟(jì)損失最大的病害之一（張宏宇 等，2010，閆霜 等，2011）。其致病菌可以在土壤中存活多年，給該病害的防治帶來(lái)很大的困難。黃瓜枯萎病的發(fā)生及發(fā)病程度的輕重，是病原菌和土壤中各種微生物相互作用的結(jié)果（鄧曉 等，2012）。土壤微生物多樣性與植物土傳病害抑制水平密切相關(guān)，根際微生物在抑制土傳病害和促進(jìn)植物生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要的作用（Garbeva et al.，2004a，2004b； 申衛(wèi)收和林先貴，2011）。PCR-DGGE技術(shù)作為一種指紋分析技術(shù)，適合用來(lái)分析環(huán)境微生物種群多樣性。近些年來(lái)，DGGE技術(shù)已經(jīng)在環(huán)境微生物研究領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用（李懷 等，2008；馬俊孝 等，2008；潘雪蓮 等，2009；Chong et al.，2009；劉曉燕 等，2014）。

為揭示枯萎病菌對(duì)黃瓜根際細(xì)菌群落的影響，本試驗(yàn)以黃瓜根際土壤總DNA為模板，采用PCRDGGE分析方法監(jiān)測(cè)接種枯萎病菌后黃瓜根際土壤細(xì)菌的變化，試圖闡述在枯萎病菌影響條件下土壤細(xì)菌群落的演替規(guī)律，為從根際微生物生態(tài)角度理解枯萎病問(wèn)題，進(jìn)而為開(kāi)展生物防治奠定 基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌 試驗(yàn)所用的黃瓜枯萎病病原菌——尖孢鐮孢菌黃瓜專(zhuān)化型（Fusarium oxysporumf. sp.cucumerinum），由大連民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 供試土壤樣品采集 試驗(yàn)田設(shè)在大連民族大學(xué)的溫室內(nèi)，2012年 4月，將從大連當(dāng)?shù)胤N子店購(gòu)買(mǎi)的黃瓜品種碧秀的種子催芽后，播種在直徑30 cm的大花盆中。待黃瓜3～4片葉時(shí)，接種黃瓜枯萎病菌。采用抖落法（張學(xué)利 等，2005）分別采集黃瓜種植前的土壤（ZQ，4月18日取樣）、接種黃瓜枯萎病菌前的土壤（JQ，5月20日取樣）、接菌后感染枯萎病菌的黃瓜根際土壤（JB，6月17日取樣）、接菌后未發(fā)病的黃瓜根際土壤（JJ，6月17日取樣）及接種清水的黃瓜根際土壤（CK，6月17日取樣）共5份黃瓜根際土壤樣品。每份樣品由5株黃瓜根際土壤充分混勻。樣品取回后置于陰涼通風(fēng)處干燥，過(guò)20目篩后備用。

1.2 方法

1.2.1 樣品總 DNA 的提取 采用堿裂解法提取供試土壤樣品總 DNA（Hu et al.，2010），用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，以λ-Hind Ⅲ作為 Marker。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 采用兩輪PCR反應(yīng)，引物見(jiàn)表1。第1輪PCR擴(kuò)增以提取的土壤總DNA為模板，采用細(xì)菌 16 S rDNA 的通用引物 F27/R1492 進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系及程序參考韋超英等（2011）的方法。第2輪PCR反應(yīng)，采用 F338-GC/R518引物擴(kuò)增細(xì)菌 16 S rDNA V3 區(qū)。反應(yīng)體系 50μL，參照楊尚東等（2014）的方法進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，63 ℃（后 20 個(gè)循環(huán)每個(gè)循環(huán)降 0.5 ℃直至降到 53 ℃）退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 7 min；擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。

表1 PCR 引物

1.2.3 DGGE 分析 采用 Bio-Rad 電泳系統(tǒng)。變性劑梯度為 30%～60%的 8%聚丙烯酰胺凝膠，60 ℃、80 V 條件下電泳 10 h。膠用 sybr green Ⅰ染色 30 min，DGGE 條帶用 Quantity One 軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取

采用堿裂解法提取的總DNA，通過(guò)與λ-Hind Ⅲ Marker比較，可以看出由該方法獲得的5個(gè)土壤樣品的總DNA片段大小超過(guò)23.1 kb，形成了較亮的清晰條帶，并且DNA片段的產(chǎn)量大，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)（圖1）。

2.2 PCR 擴(kuò)增

第1輪PCR反應(yīng)以F27/R1492為引物，得到大小約為1 500 bp的目的片段（圖2），PCR產(chǎn)物的特異性較好。第2輪PCR反應(yīng)以F338-GC/R518為引物，擴(kuò)增得到大小約為230 bp的目的片段（圖3）。

圖1 根際土壤總DNA電泳結(jié)果

圖2 各樣品16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

圖3 各樣品16S rDNA基因V3區(qū)擴(kuò)增結(jié)果

2.3 DGGE分析

對(duì)各樣品 16S rDNA V3 區(qū) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 DGGE 分析（圖4）。每個(gè)土壤樣品都檢測(cè)到了不同數(shù)目的條帶，從15個(gè)條帶（CK）到24個(gè)條帶（JJ）不等，它們之間的帶型也各不相同。接種清水的對(duì)照土壤樣品（CK）有15個(gè)條帶，細(xì)菌多樣性最低，接菌后未發(fā)病的土壤樣品（JJ）條帶數(shù)最多，細(xì)菌多樣性最高。

采用Quantity one軟件分析表明，只有少數(shù)條帶為個(gè)別樣品的特異性條帶，如條帶E1、E5及E6；多數(shù)條帶如條帶E2、E4，在各個(gè)樣品中普遍存在。這說(shuō)明樣品之間既存在著相似的細(xì)菌種群，又具有其特異的細(xì)菌種群。

圖4 PCR 產(chǎn)物的 DGGE 電泳圖譜

2.4 序列測(cè)定

從5份土壤樣品總DNA擴(kuò)增得到不同數(shù)目的 16S rDNA V3 區(qū)條帶，選擇各樣品特有的或共有的、并有一定亮度的9 個(gè)條帶，回收測(cè)序，測(cè)序后與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì)。由表2可知，條帶 A1、A2、E2、E4、E5的序列均與未培養(yǎng)細(xì)菌種屬相似性較高，分別屬于酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、 擬 桿 菌 門(mén)（Bacteroidetes）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria），這些未培養(yǎng)種群大多從污染土壤、植物根際土壤中獲得。其余幾個(gè)條帶與可培養(yǎng)細(xì)菌相似度較高，B1與Sphingomonassp.相似性達(dá) 100%。結(jié)合圖4可以看出，B1條帶所對(duì)應(yīng)的細(xì)菌是在種植前的土壤樣品（ZQ）中數(shù)量較多，在接種枯萎病菌后的各土壤樣品（JB、JJ）中數(shù)量則有所降低。E3、E6的序列都和Clostridiumsp.相似性較高。本試驗(yàn)中，接種枯萎病菌后Rhodococcus

表2 DGGE主要條帶的測(cè)序比對(duì)結(jié)果

phenolicus（E1）、Clostridiumsp.（E3、E6） 以 及3種未培養(yǎng)細(xì)菌（E2、E4、E5）數(shù)量增加，另外2種未培養(yǎng)細(xì)菌（A1、A2）數(shù)量減少。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)中，從不同樣品的DGGE電泳圖譜可以看出，每個(gè)樣品均可以分離到15～24個(gè)不等條帶，不同的條帶代表不同細(xì)菌的基因片段，表明每個(gè)樣品都存在著豐富的微生物種類(lèi)。條帶最少的是接種清水的對(duì)照土壤（CK），條帶最多的是接種枯萎病菌后未發(fā)病的土壤樣品（JJ），表明接種后未發(fā)病的土壤樣品中細(xì)菌多樣性較高。分析其原因，可能是接種枯萎病菌后誘導(dǎo)了一些微生物數(shù)量的增加，進(jìn)而使土壤中微生物的豐富性升高；接菌后枯萎病菌與土壤中其他微生物產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)作用，最終未發(fā)病可能是有益微生物的數(shù)量和種類(lèi)占了優(yōu)勢(shì)。這一結(jié)果與張鈺等（2013）的研究報(bào)道相似，即對(duì)黃瓜幼苗施用菌劑后，能使根圍和根際中細(xì)菌和放線(xiàn)菌的數(shù)量升高。

DGGE 條帶數(shù)目可以近似地體現(xiàn)細(xì)菌種群的數(shù)量，而條帶亮度則反映該種細(xì)菌數(shù)量的多少（Hu et al.，2004）。本試驗(yàn)中，接種枯萎病菌使根際土壤部分細(xì)菌的數(shù)量發(fā)生了明顯變化，這體現(xiàn)在條帶亮度增強(qiáng)或減弱上，如條帶E1、E4在樣品JB、JJ中亮度增強(qiáng)，這說(shuō)明接種枯萎病菌后使得E1、E4所代表的細(xì)菌種群在根部富集。

DGGE 指紋圖譜提供了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)，為了進(jìn)一步了解細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成，對(duì)DGGE 特殊條帶進(jìn)行切膠回收測(cè)序。從9個(gè) DGGE 條帶測(cè)序結(jié)果看，這些條帶對(duì)應(yīng)同源性最高的微生物分別屬于變形菌門(mén)（Proteobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）以及放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）。這些微生物多為未培養(yǎng)微生物，表明接種枯萎病菌對(duì)土壤中大量未培養(yǎng)細(xì)菌的影響較大，但由于這些細(xì)菌還未被培養(yǎng)或不可培養(yǎng)，因此很難鑒定它們?cè)谠簧鷳B(tài)環(huán)境中的生理生化特性及其所具備的生態(tài)功能意義。

從DGGE圖譜可以看出，接菌前（JQ）和對(duì)照（CK）中E4、A2條帶發(fā)生了變化，由于對(duì)照是在接種清水后、在植株生長(zhǎng)后期取的樣品，這就說(shuō)明隨著黃瓜的生長(zhǎng)發(fā)育，也就是說(shuō)黃瓜的不同生育期，根際土壤中細(xì)菌群落會(huì)發(fā)生改變。接種病原菌（JJ、JB）使得E1、E3、E4、E5條帶亮度增強(qiáng)，也會(huì)引起A1、A2條帶亮度的降低。其中E1、E3分 別 與Rhodococcus phenolicus、Clostridiumsp.相似性達(dá)到99%，文獻(xiàn)報(bào)道Rhodococcus phenolicus是一種硝化細(xì)菌（張光亞 等，2003），Clostridiumsp.是一種典型的產(chǎn)氫菌（許繼飛 等，2009），這兩種菌和植物病害的具體關(guān)系均未見(jiàn)報(bào)道。

在除了ZQ樣品以外的4個(gè)樣品中，Sphingomonassp.（B1）數(shù)量減少，這說(shuō)明種植黃瓜后引起了該種細(xì)菌的數(shù)量變化，Sphingomonas屬的一個(gè)顯著特征是可以降解多環(huán)或單環(huán)芳香族化合物如苯甲酸、水楊酸等，它能利用這些芳香族化合物為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)（Basta et al.，2005），而苯甲酸、水楊酸及其衍生物是黃瓜根系分泌物中的重要化感物質(zhì)（Pramanik et al.，2000）。本試驗(yàn)得到的細(xì)菌群落 DGGE 圖譜與胡元森等（2007）研究結(jié)果不一致，胡元森研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜連作引起土壤中Sphingomonassp.數(shù)量增加。本試驗(yàn)后期接入了枯萎病菌，而胡元森研究的是連作黃瓜的根際土壤，這似乎說(shuō)明根際土壤中細(xì)菌群落受病菌影響較大。

有研究表明，根系分泌物是由多種物質(zhì)組成，包括各種低分子有機(jī)物、各種離子等（羅永清 等，2012）。根系分泌物會(huì)改變根際細(xì)菌群落組成（Kozdroj & van Elsas，2000），添加根系分泌物能有效促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)（T é cher et al.，2011）。而根系分泌物也受到各種因素的影響，如芳香族化合物等有機(jī)物質(zhì)（Hoang et al.，2011）、真菌侵染（Norman & Hooker，2000）、金屬元素（Meier et al.，2012）等。本試驗(yàn)中，DGGE 9個(gè)主要條帶所代表的細(xì)菌并未發(fā)現(xiàn)與黃瓜枯萎病的發(fā)生有著明顯的關(guān)聯(lián)，但是，枯萎病菌的接入可能是通過(guò)改變黃瓜根系分泌物的產(chǎn)生或者其中的各種離子成分等進(jìn)而改變了黃瓜根際的生態(tài)環(huán)境，從而影響了根際的細(xì)菌群落組成，還有待進(jìn)一步研究。

鄧曉，李勤奮，侯憲文，武春媛，李光義．2012．香蕉枯萎病不同感病級(jí)別植株根際與非根際土壤微生物物種多樣性研究．中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，28（30）：239-248．

胡元森，吳坤，李翠香，賈新成．2007．黃瓜連作對(duì)土壤微生物區(qū)系影響Ⅱ——基于 DGGE方法對(duì)微生物種群的變化分析．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，40（10）：2267-2273．

李懷，關(guān)衛(wèi)省，歐陽(yáng)二明，王曉慧，張杰．2008．DGGE技術(shù)及其在環(huán)境微生物中的應(yīng)用．環(huán)境科學(xué)與管理，（10）： 93-96，99．

劉曉燕，張磊，韋澤秀，朱丹，王曉鋒，吳先勤，丁紅利．2014．用PCR-DGGE研究菌肥對(duì)西藏青稞土壤微生物群落多樣性的影響．西南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，36（7）：39-48．

羅永清，趙學(xué)勇，李美霞．2012．植物根系分泌物生態(tài)效應(yīng)及其影響因素研究綜述．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，23（12）：3496-3504．

馬俊孝，孔健，季明杰．2008．利用PCR-DGGE技術(shù)分析微生態(tài)制劑在傳代過(guò)程中的菌群變化．山東大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版，43（7）：56-60．

潘雪蓮，黃晟，方昊，徐軍，郭曉峰，陳旸，崔益斌．2009．黃土高原土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的PCR-DGGE分析．生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，25（3）：39-43，48．

申衛(wèi)收，林先貴．2011．三種不同利用方式土壤上黃瓜根際微生物群落差異．土壤學(xué)報(bào)，48（3）：654-658．

韋超英，楊濱銀，方新湘，婁愷，晁群芳．2011．適用變性梯度凝膠電泳分析的石油污染土壤微生物DNA模板制備的研究．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，39（16）：9676-9679，9722．

許繼飛，任南琪，邱頡，蘇東霞．2009．木糖發(fā)酵產(chǎn)氫菌的篩選及其生長(zhǎng)產(chǎn)氫特性研究．微生物學(xué)通報(bào)．36（4）：467-472．

閆霜，吳洪生，周曉冬，張富存，劉小雪，王增輝，孔祥云，劉正柱．2011．黃瓜枯萎病生物防治研究進(jìn)展．山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，43（1）：86-92．

楊尚東，趙久成，郭伊娟，吳俊，龍明華．2014．番茄青枯病罹病植株和健康植株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的初步分析．中國(guó)蔬菜，（8）：25- 29．

張光亞，陳美慈，韓如旸，閔航．2003．一株異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離及系統(tǒng)發(fā)育分析．微生物學(xué)報(bào)，42（2）：156-161．

張宏宇，陳霞，左洪波，張艷菊，秦智偉，周秀艷．2010．中國(guó)現(xiàn)行推廣黃瓜品種及種質(zhì)資源對(duì)枯萎病的抗病性評(píng)價(jià)．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，41（5）：36-41．

張學(xué)利，楊樹(shù)軍，張百習(xí)，袁春良．2005．不同林齡樟子松根際與非根際土壤的對(duì)比．福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，25（1）：80-84．

張鈺，孫錦，郭世榮．2013．基質(zhì)中添加微生物制劑對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)和枯萎病抗性的影響．西北植物學(xué)報(bào)，33（4）： 780-786．

Basta T，Buerger S，Stolz A．2005．Structural and replicative diversity of plasmids from sphingomonads that degrade polycyclic aromatic compounds and xenobiotics．Microbiology，151： 2025-2037．

Chong C W，Dunn M J，Convey P，Tan G Y A，Wong R C S，Tan I K．2009．Environmental influences on bacterial diversity of soils on Signy Island，maritime Antarctic．Polar Biology，32（11）：1571-1582．

Garbeva P，van Veen J A，van Elsas J D．2004a．Assessment of the diversity and antagonists towardsRhizoctonia solaniAG3 ofPseudomonasspecies in soil from different agricultural regimes．FEMS Microbiological Ecology，47：51-64．

Garbeva P，van Veen J A，van Elsas J D．2004b．Microbial diversity in soil：selection of microbial populations by plant and soil type and implications for soil suppressiveness．Annual Review of Phytopathology，42：243-270．

Hoang H，Yu N，Toyama T，Inoue D，Sei K，Ike M．2010．Accelerated degra-dation of a variety of aromatic compounds bySpirodela polyrrhiza-bacterial associations and contribution of root exudates released fromS．polyrrhiza．Journal of Environmental Sciences，22：494-499．

Hu Y C，Liu Z H，Yan J F，Qi X H，Li J，Zhong S Q，Yu J C，Liu Q．2010．Developed DNA extraction method for different soil samples．Journal of Basic Microbiology，50：401- 407．

Hu Y S，Wu K，Liu N，Chen H G，Jia X C．2004．Dynamics of microbial communities in bulk and developing cucumber rhizosphere soil．Agricultural Sciences in China，3（5）：376-383．

Kozdroj J，van Elsas J D．2000．Response of the bacterial community to root exudates in soil polluted with heavy metals assessed by molecular and cultural approaches．Soil Biology and Biochemistry，32：1405-1417．

Lane D J．1991．16S/23S rDNA sequencing// Stackebrandt E，Goodfellow M．Nucleic acid techniques in bacterial systematics．New York：Wiley：115 -175．

Meier S，Alvear M，Borie F，Aguilera P，Ginocchio R，Cornejo P．2012．Influence of copper on root exudate patterns in some metallophytes and agricultural plants．Ecotoxicology and Environmental Safety，75：8-15．

Muyzer G，de Waal E C，Uitterlinden A G．1993．Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA．Applied Environmental Microbiology，59（3）：695-700．Norman J R，Hooker J E．2000．Sporulation ofPhytophthora fragariaeshows greater stimulation by exudates of non-mycorrhizal than by mycorrhizal strawberry roots．Mycological Research，104：1069-1073．Pramanik M H R，Nagai M，Asao T，Matsui Y．2000．Effects of temperature and photoperiod on phytotoxic root exudates of cucumber （Cucumis sativus） in hydroponic culture．Journal of Chemical Ecology，26（8）：1953-1966．

T é cher D，Laval-Gilly P，Henry S，Bennasroune A，F(xiàn)ormanek P，Martinez-Chois C，D′Innocenzo M，Muanda F，Dicko A，Rej?ek K，F(xiàn)alla J．2011．Contribution ofmiscanthus×giganteusroot exudates to the biostimulation of PAH degradation：an in vitro study．Science of the Total Environment，409：4489-4495．