CagA+H.pylori對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖及TβRI、SMAD4和SMAD7表達(dá)的影響

劉 麗，黃贊松,*，黃衍強(qiáng)，周喜漢，尹毅霞，覃月秋

(1.廣西醫(yī)科大學(xué) 研究生學(xué)院2011級(jí)12班， 廣西 南寧 530021； 右江民族醫(yī)學(xué)院 2.消化疾病研究所 附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科；3.微生物免疫學(xué)教研室， 廣西 百色 533000)

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CagA+H.pylori對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖及TβRI、SMAD4和SMAD7表達(dá)的影響

劉 麗1，黃贊松1,2*，黃衍強(qiáng)3，周喜漢2，尹毅霞2，覃月秋2

(1.廣西醫(yī)科大學(xué) 研究生學(xué)院2011級(jí)12班， 廣西 南寧 530021； 右江民族醫(yī)學(xué)院 2.消化疾病研究所 附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科；3.微生物免疫學(xué)教研室， 廣西 百色 533000)

肝癌病因復(fù)雜，有研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌 (Helicobacterpylori,H.pylori)與肝癌相關(guān)，機(jī)制未明。CagA是H.pylori的毒力因子， CagA+H.pylori與肝癌可能有聯(lián)系。TGF-β(transforming growth factor beta, TGF-β)/Smads信號(hào)通路任何環(huán)節(jié)異常，均會(huì)造成腫瘤始動(dòng)。TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)依靠TβR及Smads，本實(shí)驗(yàn)主要探討CagA+H.pylori對(duì)肝癌細(xì)胞的作用及對(duì)TβRI、SMAD4和SMAD7表達(dá)的影響，為研究CagA+H.pylori在肝癌發(fā)病機(jī)制中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞: 人肝癌HepG2細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Gibico公司)的改良型1640培養(yǎng)基(Hyclone公司) (簡(jiǎn)稱培養(yǎng)液)，置飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2H.pylori: 參照文獻(xiàn)[1]鑒定CagA+H.pylori，培養(yǎng)后收集，紫外分光光度儀檢測(cè)濃度，將菌液調(diào)整為1.0×106CFU(菌落形成單位，colony formation unit)/mL后連續(xù)5次10倍稀釋， 1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102和1.0×101CFU/mL。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況:用MTT法檢測(cè)CagA+H.pylori作用24 h對(duì)細(xì)胞增殖的影響，計(jì)算公式：增殖率(PI)=(實(shí)驗(yàn)組A值-對(duì)照組A值)/對(duì)照組A值×100%(表2)。

1.4 CagA+H.pylori與細(xì)胞孵育:細(xì)胞調(diào)整為1×106個(gè)/mL，接種到培養(yǎng)瓶，置飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換無血清的培養(yǎng)液同步化處理24 h，各瓶加上述不同濃度CagA+H.pylori，每個(gè)濃度重復(fù)3次，作用24 h。陰性對(duì)照組不加CagA+H.pylori，加等量培養(yǎng)液。

1.5 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):用Trizol試劑提取總RNA。按Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser (perfect real time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)說明書制備cDNA。

1.6 目的基因擴(kuò)增:按super real premix plus(SYBR Green)熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版試劑盒(TianGen公司)說明書操作。計(jì)算公式:擴(kuò)增倍數(shù)=2-△△CT。引物序列(表1)。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 CagA+H.pylori對(duì)HepG2細(xì)胞的作用:CagA+H.pylori在濃度1.0×101和1.0×102CFU/mL時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖，濃度為1.0×103、1.0×104、1.0×105和1.0×106CFU/mL時(shí)抑制細(xì)胞增殖，菌液濃度越高，抑制作用越明顯 (表2)。

2.2 TβRI、SMAD4和SMAD7 mRNA在HepG2細(xì)胞中表達(dá)水平:CagA+H.pylori濃度在1.0×101和1.0×102CFU/mL時(shí)抑制TβRI、 SMAD4表達(dá)， 促進(jìn)SMAD7表達(dá)， 濃度為1.0×103、1.0×104、1.0×105和1.0×106CFU/mL時(shí)TβRI、SMAD4表達(dá)增加，SMAD7表達(dá)下調(diào)，菌液濃度越高，作用越明顯 (表3)。

表2 各組HepG2細(xì)胞增殖率比較

*P<0.05 compared with control group.

3 討論

研究表明CagA+H.pylori可誘導(dǎo)原癌基因表達(dá)升高，肝細(xì)胞動(dòng)力學(xué)異常。CagA+H.pylori能干擾細(xì)胞增殖、凋亡，促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)，在肝膽管型肝癌中可能起著重大作用[2]。許多腫瘤細(xì)胞或組織都有TβRI在mRNA或蛋白水平上的表達(dá)降低、缺失或突變，提示TβRI是在細(xì)胞膜發(fā)揮作用的抑癌基因。Smad4在腫瘤發(fā)病中表達(dá)下降或突變，從而不能發(fā)揮調(diào)控轉(zhuǎn)錄作用。Smad7可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TβRI，而抑制TGF-β1/Smads信號(hào)傳導(dǎo)，研究表明通過下調(diào)Smad7可抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)[3]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)CagA+H.pylori濃度在101和102CFU/mL時(shí)促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞增殖，抑制TβRI、SMAD4表達(dá)，促進(jìn)SMAD7表達(dá)，濃度為103、104、105和106CFU/mL時(shí)抑制細(xì)胞增殖，TβRI、SMAD4表達(dá)增加，SMAD7表達(dá)下調(diào)，研究發(fā)現(xiàn)[2]低濃度的CagA+H.pylori能促進(jìn)膽管細(xì)胞癌KKU-100細(xì)胞生長(zhǎng)，而高濃度CagA+H.pylori抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，但目前尚未見CagA+H.pylori感染肝癌HepG2細(xì)胞后TβRI、SMAD4和SMAD7在肝癌細(xì)胞表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道。據(jù)此我們推斷CagA+H.pylori可影響肝癌HepG2細(xì)胞增殖，表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)細(xì)胞增殖，高濃度起抑制細(xì)胞增殖作用，機(jī)制可能是通過影響TβRI、SMAD4和SMAD7的表達(dá)而起作用，確切的作用及機(jī)制需要更多的實(shí)驗(yàn)和進(jìn)一步研究證實(shí)。

表3 TβRI、SMAD4和SMAD7 mRNA相對(duì)定量

[1] 黃衍強(qiáng),歐平,周喜漢,等.CagA+及VacA+幽門螺桿菌對(duì)克拉霉素的耐藥性突變分析[J].山東醫(yī)藥,2010, 50:37- 39.

[2] Boonyanugomol W, Chomvarin C, Baik SC,etal.Role of cagA-positive Helicobacter pylori on cell proliferation,apoptosis,and inflammation in biliary cells[J].Dig Dis Sci, 2011,56:1682- 1692.

[3] 范宜鋒,王文奇,白文坤,等.他莫昔芬對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖和Smad7表達(dá)的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2009, 47:58- 60.

2014- 02- 07

2014- 05- 30

廣西自然科學(xué)基金 (0542119);廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題基金 (200887);廣西教育廳重點(diǎn)課題 (201202ZD078)

1001-6325(2015)01-0101-02

R575

A

*通信作者(corresponding author)：huangzansong@hotmail.com