丙二醛通過抑制Nrf2/ARE促進腎小球系膜細胞凋亡

趙 璐，孫俊波，金小琴

(河南中醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院 內分泌科， 河南 鄭州 450008)

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研究論文

丙二醛通過抑制Nrf2/ARE促進腎小球系膜細胞凋亡

趙 璐，孫俊波*，金小琴

(河南中醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院 內分泌科， 河南 鄭州 450008)

目的探索丙二醛(MDA)對糖尿病腎病的影響機制。方法用終濃度為0、1、5、10和50 μmol/L的MDA處理腎小球系膜細胞(GMC)，MTT法檢測細胞活性，AnnexinV-FITC法檢測細胞凋亡， RT-PCR和Western blot法檢測Nrf2，HO- 1和γGCL表達。結果MDA 劑量依賴的抑制腎小球系膜細胞的活性。MDA濃度為5 μmol/L可誘導細胞內大量活性氧(ROS)產生(P<0.05)，抗氧化劑tBHQ可緩解MDA誘導的細胞活性的下降。MDA抑制了抗氧化反應原件(ARE)HO- 1和γGCL的表達，以及Nrf2的表達水平(P<0.05)。結論MDA可通過抑制Nrf2/ARE來調控ROS生成，抑制腎小球系膜細胞的活性。

丙二醛；糖尿病腎?。荒I小球系膜細胞；活性氧；Nrf2

腎小球系膜細胞(glomerular mesangial cell，GME)對維持腎小球毛細血管網的結構和功能的完整性具有重要的作用。腎小球硬化是導致糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的主要原因，然而GME的活性下降可加速腎小球硬化，是糖尿病腎病主要的發(fā)生機制[1- 3]。近期研究顯示，在糖尿病腎病患者體內MDA水平上升，且與DN的發(fā)生和發(fā)展有密切聯(lián)系[4]。MDA對腎小球系膜細胞的影響以目前

尚無報道。

1 材料與方法

1.1 材料

腎小球系膜細胞(GMC)，接種自中國協(xié)和醫(yī)科大學細胞保藏室。DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)，胎牛血清(FCS)(杭州四季青公司)。丙二醛二乙縮醛、四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)： 將GMC懸液接種于含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當細胞生長增殖至80%以上匯合時，可進行細胞傳代。

1.2.2 丙二醛的配置： 丙二醛二乙縮醛，通過水解得到10 mmol/L母液。隨后取0.125 mL，與2 mL濃度為1 mol/L的HCl充分混勻，并于40 ℃加熱2 min。然后加入6 mol/L的NaOH，將pH定到7.4。

1.2.3 MTT檢測細胞活性： 用液體培養(yǎng)基將細胞濃度調為1×104個/mL，然后于96孔板分別培養(yǎng)，每孔加入100 μL培養(yǎng)液。在96孔板中，細胞液中按照濃度為0、1、5、10和50 μmol/L的濃度加入MDA，每個梯度重復做3組，細胞培養(yǎng)96 h后，每孔中加20 μL MTT后繼續(xù)培養(yǎng)3 h。將培養(yǎng)液離心后，棄上清，加人150 μL的培養(yǎng)液，于室溫振蕩10 min充分混勻，然后于490 nm波長下用酶標儀測定吸光度值(A)。每次實驗平行重復3次。

1.2.4 Anex V-FITC檢測細胞凋亡： 采用Annexin V-FITC法檢測細胞凋亡，用0.25%胰蛋白酶消化腎小球系膜細胞，隨后用PBS洗滌2次，3 000 r/min離心4 min，(1～5)×105個/L收集細胞。用700 μL結合緩沖液重懸，加5 μL Annexin V-FITC混勻，再加5 μL Propidium Iodide混勻。室溫、避光孵育10～15 min，使用流式細胞儀分析結果。

1.2.5 ROS水平的測定： 取培養(yǎng)的細胞加入DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24 h，根據(jù)需要將不同濃度的MDA加入24孔板48 h，PBS清洗后，加入含有DCFH-DA(2′, 7′-dichlorofluorescein diacetate) (10 μmol/L)探針的無血清培養(yǎng)基，避光孵育1 h。棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，隨后用含有MDA的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)30 min。棄掉培養(yǎng)液，將細胞置于激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長530 nm處觀察結果。

1.2.6 Western blot法檢測： 將細胞棄去培養(yǎng)基，用4 ℃預冷的PBS緩沖液洗滌，加入200 μL預冷的裂解液，冰上放置20 min，4 ℃，12 000×g離心10 min，收集上清測即為總蛋白。取200 μg總蛋白，加入上樣緩沖液至總體積為30 μL，SDS-PAGE電泳。半干轉法將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，用5%脫脂奶粉在4℃下過夜孵育，隨后用TBST洗滌3次，加入一抗37℃孵育1 h，再次用TBST洗3次，加入二抗。ECLA底物顯色，紅外線燈照射顯影。

1.2.7 RT-PCR檢測： 用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，經反轉錄合成cDNA。隨后用SYBR Green試劑盒進行反轉錄PCR，各組實驗均重復3次并取其均值，具體操作步驟如下，1 μL 的cDNA，分別加入2 μL Nrf2，HO- 1和γGCL的上下游引物，加入緩沖液后，將終濃度定為10 μL，程序為，首次95 ℃預變性10 min，隨后進行94 ℃變性10 s，58 ℃下15 s，72 ℃延伸15 s，循環(huán)30次，并以β-actin作為對照，結果以目的基因與內參吸光度的比值表示。Nrf2、HO- 1和γGCL的上下游引物分別為Nrf2: 5′-TCTC CTCGCTGGAAAAAGAA-3′，5′-ATTTCGTGTCGGTCG TGTAA-3′；HO- 1: 5′-CTGTGTAACCTCTGCTGTTCC-3′，5′-CCACACTACCTGAGTCTACC-3′；γGCL：5′-C CTTCTGGCACAGCACGTTG-3′，5′-TAAGACGGCATC TCGCTCCT-3′。

1.2.8 構建Nrf2過表達細胞： 首先將Nrf2全基因連接到穿梭載體，取對數(shù)期增殖的GMC配置細胞懸液，加入6孔板(約5×104個/孔)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)1 h，加入含有Nrf2完整基因的腺病毒共培養(yǎng)3 d。取出，加入嘌呤霉素繼續(xù)培養(yǎng)2 d篩選過表達Nrf2的細胞。含有Ad-GFP的空載體作為對照，并用基因測序進行鑒定。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 MDA 劑量依賴的抑制GMC的活性

MDA劑量依賴的抑制GMC的活性(圖1A,B)。與對照組(12%)相比，50 μmol/L MDA顯著誘導了細胞的凋亡(41%)(圖1C，D)。

2.2 MDA通過誘導ROS產生降低細胞活性

MDA劑量依賴的誘導活性氧(ROS)產生，MDA濃度大于5 μmol/L時，ROS生成量約為對照的1.7倍(P<0.05)(圖2A)。在50 μmol/L MDA刺激細胞培養(yǎng)36 h時，ROS生成開始顯著升高(P<0.05)(圖2B)。MDA和tBHQ同時作用下，細胞活性顯著上升(83%)(P<0.05)(圖2C)。

2.3 MDA抑制抗氧化反應原件HO- 1和γGCL

MDA誘導下，HO- 1和γGCL表達下降(圖3A)。此外，HO- 1和γGCL的mRNA 水平明顯低于對照組(圖3B)。

2.4 MDA通過抑制 Nrf2/ARE影響細胞活性

MDA誘導條件下，Nrf2的表達水平明顯下降(圖4A，B)。過表達Nrf2的細胞在MDA誘導條件下HO- 1和γGCL表達升高(P<0.05)(圖4C)。過表達Nrf2能夠明顯抑制MDA誘導的活性氧的上升(圖4D)。

A.MDA inhibits glomerular mesangial cell viability in a dose-dependent manner; B.MDA inhibits glomerular mesangial cell viability in a time-dependent manner; C.cell apoptosis was detected via PI staining and the annexin Ⅴ method after MDA stimulation, followed by flow cytometry; D.columns show the mean of data obtained from three independent experiments;*P<0.05 compared with control

圖1 MDA劑量依賴的抑制GMC的活性和促進凋亡

Fig 1 MDA dose-dependently inhibits glomerular mesangial cell viability and promote apoptosis

A.MDA promotes ROS regeneration in a dose-dependent manner; B.MDA promotes ROS regeneration in a time-dependent manner; C.MDA inhibits cell viability;*P<0.05 compared with control

圖2 MDA通過誘導ROS產生降低細胞活性

Fig 2 MDA inhibites cell viability by induction of ROS regeneration

A.MDA inhibits the protein expression levels of HO-1 and γ-GCL; B.MDA inhibits the mRNA expression levels of HO-1 and γ-GCL;*P<0.05 compared with control圖3 MDA抑制抗氧化反應原件HO- 1和γGCLFig 3 MDA inhibits expression of two antioxidant responsive elements-HO- 1 and γGCL

3 討論

DN是糖尿病重要的并發(fā)癥之一，是終末期腎衰以及糖尿病致死的主要原因之一[5]。近期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者MDA水平升高與糖尿病各種并發(fā)癥的發(fā)生具有密切聯(lián)系，是DN的獨立危險因素[6]。但是MDA在DN發(fā)生和發(fā)展中的具體作用目前尚不清楚。

糖尿病腎病的主要原因之一是腎小球硬化，GMC活性的降低甚至凋亡是造成腎小球硬化的主要原因[7]。本研究發(fā)現(xiàn)MDA能夠劑量依賴和時間依賴的抑制GMC的活性，并促進腎小球系膜細胞凋亡，提示MDA可通過影響GMC的活性，進而促進DN的發(fā)生。

氧化應激產物的過度表達常常是引起細胞DNA 損傷，細胞下降甚至凋亡的重要原因[8]。本研究發(fā)現(xiàn)MDA劑量依賴的誘導了ROS的產生，并且隨著時間延長，ROS含量上升，加重細胞內氧化應激，提示MDA可通過加重細胞氧化應激影響細胞活性。tBHQ作為一種高效的抗氧化劑，能夠有效降低細胞內ROS活性，且無細胞毒性作用。 tBHQ能夠緩解MDA對細胞活性的抑制作用，提示MDA通過促進ROS，加重氧化應激抑制了細胞活性。

血紅素氧化酶-1(HO- 1)能夠通過抗氧化應激保護細胞免受氧化應激的損傷[9]。谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)對機體的抗氧化損傷具有重要調控作用[10]。在體內和體外，抗氧化反應原件(ARE)HO- 1和γGCL表達的上調，能夠有效的保護ROS對細胞的氧化應激損傷[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，MDA能夠抑制HO- 1和γGCL表達，提示MDA通過抑制ARE，限制了細胞對氧化應急損傷的保護。

A.MDA inhibits the protein expression level of Nrf2; B.MDA inhibits the mRNA expression level of Nrf2; C.the protein expression levels of HO-1 and γ-GCL in MDA group and MDA+Nrf2 group; D.the ROS regeneration in MDA group and MDA+Nrf2 group;*P<0.05 compared with control圖4 MDA通過抑制 Nrf2/ARE影響細胞活性Fig 4 MDA impacts cell viability by inhibition of Nrf2/ARE pathway

核因子NFE2相關因子2 Nrf2是機體在應對ROS損害重要的反應蛋白，具有激活ARE的作用[12]。本實驗證實MDA顯著抑制了Nrf2的表達水平，而過表達Nrf2可以緩解MDA對HO- 1和γGCL表達的抑制作用，同時提高細胞的活性，因而提示MDA主要通過抑制Nrf2表達，抑制了HO- 1和γGCL的表達，促進了細胞內ROS的產生。

綜上，本實驗證實MDA可通過抑制Nrf2/ARE通路促進ROS生成，誘導了GMC的凋亡。因此，本研究將為DN可能的發(fā)生機制提供線索，并為DN的防治提供可能的分子靶標。

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每天2餐有助減肥

據(jù)英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2013-06-25報道，您也許曾聽說“少量多餐”有助于減肥。但是現(xiàn)在有證據(jù)表明，“少量多餐”也許不是降低食欲的好方法，對有些人反而會導致增重。

美國糖尿病學會會議上發(fā)表的一項研究表明，患有二型糖尿病的患者如果每天只吃2餐，會比那些吃6頓飯但攝入相同熱量的人減下更多體質量。

該研究的主持人卡列奧娃(Hana Kahleova)供職于布拉格臨床與實驗醫(yī)學研究所。在她指導下，54名患者在12周內遵守兩種不同的餐飲計劃。一種是6頓飯，另外一種是2頓飯(早餐和中餐)，但是患者攝入同樣的營養(yǎng)和熱量。

兩種計劃的參與者都減輕了體質量。但是只吃兩餐的人減重更多。他們的身高體質量比(BMI)平均下降了1.23。每天吃6餐的人也減重，但是他們的平均BMI只下降了0.82。正常人的BMI應在18.5～24.9之間。在此研究中，平均BMI為32.6。

MDA accelerates the glomerular mesangial cell apoptosis through inhibition of Nrf2/ARE

ZHAO Lu, SUN Jun-bo*, JING Xiao-qin

(Dept. of Endocrinology, the Third Affiliated Hospital of Henan College of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China)

Objective To explore the function of MDA on diabetic nephropathy. Methods Glomerular mesangial cells (GMC) were pretreated with MDA at a final concentrations of 0 μmol/L, 1 μmol/L, 5 μmol/L, 10 μmol/L and 50 μmol/L. MTT assay was used to examine the viability of GMC). AnnexinV-FITC was used to evaluate effect of MDA on cell apoptosis. RT-PCR and western blot were used to analyze the expression of Nrf2, HO- 1 and γGCL. Results MDA treatment inhibited GMC viability in a dose-dependent manner. MDA at the concentration of more than 5 μmol/L induced mass production of ROS in GMC (P<0.05). In addition, antioxygen of tBHQ may relieve MDA-induced reduction of cell viability. MDA inhibited the expression of HO- 1, γGCLand Nrf2 (P<0.05).Conclusions MDA inhibites GMC viability and promotes the cell apoptosis by ROS production through inhibiting Nrf2/HO- 1-γGCL.

malondialdehyde; diabetic nephropathy; glomerular mesangial cell; ROS; Nrf2

2014- 04- 01

2014- 08- 25

1001-6325(2015)01-0069-05

R363

A

*通信作者(corresponding author)：13838099075@139.com