Gli2基因沉默逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞系SMMC- 7721的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

鄧大煒，孔憲炳*，王 平，于慶三，王 強(qiáng)

(重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 1.肝膽外科; 2.胃腸外科, 重慶 400016)

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研究論文

Gli2基因沉默逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞系SMMC- 7721的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

鄧大煒1，孔憲炳1*，王 平1，于慶三1，王 強(qiáng)2

(重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 1.肝膽外科; 2.胃腸外科, 重慶 400016)

目的探討膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白2(Gli2)對(duì)肝癌細(xì)胞系SMMC- 7721上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和侵襲能力的影響及機(jī)制。方法合成shRNA-Gli2、shRNA-NC病毒載體，實(shí)驗(yàn)設(shè)shRNA-Gli2組、shRNA-NC組和空白組，轉(zhuǎn)染SMMC- 7721細(xì)胞。用Transwell小室和細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲及黏附能力；用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞間Gli2、E-cadherin、N-cadherin及vimentin基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果在不同肝癌細(xì)胞系中，隨著肝癌細(xì)胞系侵襲能力的增強(qiáng)，Gli2的表達(dá)逐漸增高,shRNA-Gli2組與對(duì)照組相比侵襲能力降低，同種黏附能力增加，異種黏附能力降低(P<0.05)。shRNA-Gli2組與對(duì)照組相比,E-cadherin表達(dá)明顯增高而N-cadherin和vimentin表達(dá)明顯降低(P<0.05)。結(jié)論沉默Gli2的表達(dá)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞SMMC- 7721 EMT的反轉(zhuǎn)，并降低其侵襲能力，機(jī)制可能與E-cadherin的上調(diào)和N-cadherin、vimentin的下調(diào)有關(guān)。

Gli2;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT);SMMC- 7721;侵襲;黏附

在全球范圍內(nèi)，肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的死亡率占所有腫瘤的第3位[1],肝癌患者高死亡率的主要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移[2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[3]。EMT是指在特定的情況下腫瘤細(xì)胞失去彼此間的連接，獲得間充質(zhì)表型及運(yùn)動(dòng)能力增加現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)Sonic hedgehog (Shh)信號(hào)通路在各種類型腫瘤中異常激活[4],膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白2(Glioma-associated oncogenehomologue 2,Gli2)作為該通路的最重要的終末效應(yīng)分子，其活化后能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖等來參與腫瘤的惡性進(jìn)程[5- 6]。Gli2是否通過EMT影響肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究較少。本研究利用基因沉默技術(shù)沉默肝癌細(xì)胞系SMMC- 7721中Gli2基因，觀察沉默Gli2基因?qū)MMC- 7721細(xì)胞EMT的影響，探討Gli2是否通過EMT影響肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

Transwell小室、matrigel基質(zhì)膠(BD公司),shRNA慢病毒(上海紐恩生物科技公司)。qRT-PCR相關(guān)試劑盒(Takara公司)?？笹li2蛋白抗體(Santa Cruze公司)、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術(shù)公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔二抗(ABgent公司),Western blot相關(guān)試劑盒(上海碧云天公司)。

1.2 細(xì)胞系和分組

肝癌細(xì)胞系SMMC- 7721,肝癌細(xì)胞系Huh7、肝癌細(xì)胞系HepG2、正常肝細(xì)胞系L02和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系926(均重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室)。細(xì)胞用RPMI 1640或DMEM加10%胎牛血清、37 ℃、5% CO2、常規(guī)濕度培養(yǎng)。將細(xì)胞分為shRNA-Gli2組(轉(zhuǎn)染shRNA-Gli2的SMMC- 7721細(xì)胞)、shRNA-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的SMMC- 7721細(xì)胞)、空白組(未經(jīng)處理的SMMC- 7721細(xì)胞)。

1.3 sh-RNA慢病毒轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染率測(cè)定

shRNA-Gli2序列:5′-GATCTGGACAGGGATGA CT-3′;shRNA-NC序列:5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′,按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI)為30,72 h后于熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

用Trizol法提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。各目的基因引物序列見表1,用CFX96擴(kuò)增儀擴(kuò)增各目的基因。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,56～60 ℃不等退火30 s,72 ℃退火1 min,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。根據(jù)各目的基因2-ΔΔCT值計(jì)算表達(dá)量,所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)

用蛋白裂解液提取目的細(xì)胞蛋白,BCA法檢測(cè)蛋白濃度。按每孔50 μg上樣，按濃縮膠70 V分離膠100 V電壓下分離，再用250 mA恒流將凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入稀釋的一抗,4 ℃孵育過夜,PBST充分漂洗后加入二抗,37 ℃孵育1 h,ECL顯色，測(cè)吸光度值，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Transwell小室侵襲遷移實(shí)驗(yàn)

將1∶3 Matrigel (50 mg/L) 稀釋液40 μL鋪于Transwell(孔徑大小0.8 μm)上室面。收集各組細(xì)胞懸液5×104個(gè)/400 μL加入上室，下室加入600 μL全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng),24 h后擦去上室的基質(zhì)膠和細(xì)胞，結(jié)晶紫或蘇木素染色15 min,多聚甲醛固定后封片并在顯微鏡下攝片計(jì)數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.7 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)期的SMMC- 7721細(xì)胞和926細(xì)胞制成1×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液。取兩種細(xì)胞懸液各100 μL接種于96孔板內(nèi)除第1、7和12列的A-H排孔內(nèi)過夜。次日消化各組細(xì)胞，制成1×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液。取shRNA-Gli2組細(xì)胞100 μL/孔加至96孔板第3～7列A-H孔內(nèi),shRNA-NC組細(xì)胞100 μL/孔加入第8～12列A-H孔內(nèi)，第1列所有孔內(nèi)均加入100 μL無血清培養(yǎng)基。每隔30 min分別吸出3、8列,4、9列,5、10列,6、11列,7、12列所有孔的培養(yǎng)液。以上所有孔清洗、離心。除D、E排外的所有孔用MTT法測(cè)量A值。計(jì)算各組同(異)種黏附率=[A同(異)種各時(shí)間點(diǎn)-A2ABC(FGH)]/A7ABC(FGH),熒光顯微鏡觀測(cè)D和E排各孔熒光強(qiáng)主，攝像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 4株細(xì)胞系中Gli2的表達(dá)及侵襲能力

Gli2的表達(dá)(圖1A)在SMMC- 7721最高,Huh7、HepG2中表達(dá)無明顯差異,L02中幾乎不表達(dá)，細(xì)胞間表達(dá)差異P<0.05。體外侵襲實(shí)驗(yàn)表明(圖2B)，低分化肝癌細(xì)胞系SMMC- 7721侵襲能力最強(qiáng)，侵襲能力顯著高于高分化肝癌細(xì)胞系Huh7和HepG2,正常肝細(xì)胞L02侵襲能力最弱，細(xì)胞間侵襲能力差異(P<0.05)。

2.2 shRNA-Gli2慢病毒沉默載體轉(zhuǎn)染效果鑒定

如說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染。72 h后通過熒光(圖2A)觀察,可見轉(zhuǎn)染shRNA-Gli2慢病毒沉默載體的SMMC- 7721細(xì)胞有綠色熒光蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率約95%(圖2B)。72 h后shRNA-Gli2組中Gli2表達(dá)明顯比shRNA-NC組和空白組低(P<0.05)(圖2C,D)。

2.3 沉默Gli2能使SMMC- 7721細(xì)胞同種黏附增加異種黏附降低

同種黏附實(shí)驗(yàn)中,shRNA-NC組(圖3A)黏附的細(xì)胞數(shù)少于shRNA-Gli2組(圖3B)(P<0.05);異種黏附實(shí)驗(yàn)中,shRNA-Gli2(圖3C)組黏附的細(xì)胞均少于shRNA-NC組(圖3D),(P<0.05)。酶標(biāo)儀下測(cè)得A值，用上訴公式再算出黏附率，如表2、3所示shRNA-Gli2組的同種黏附率高于shRNA-NC組及空白組，異種黏附率低于shRNA-NC組及空白組(P<0.05)。

2.4 沉默Gli2能抑制SMMC- 7721細(xì)胞的侵襲能力

空白組(圖4A)穿過細(xì)胞為(146.0±4.24)個(gè)和shRNA-NC組(圖4B)之間無明顯差異,shRNA-Gli2組(圖4C)穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)(40.0±1.41)個(gè)明顯少于shRNA-NC組及空白組(P<0.05)。

2.5Gli2能調(diào)控E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表達(dá)

轉(zhuǎn)染shRNA-Gli2組SMMC- 7721細(xì)胞中間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和vimentin的表達(dá)明顯低于shRNA-NC組和空白組, 然而上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)明顯增加(P<0.05)(圖5)。

圖1 4株細(xì)胞系中Gli2的表達(dá)及侵襲能力

*P<0.05 compared with shRNA-NC group and blank group

A.adhered cells of shRNA-NC group in the homogeneous cells intercellular adhesion experiment; B.adhered cells of shRNA-Gli2 group in the homogeneous cells intercellular adhesion experiment; C.adhered cells of shRNA-Gli2 group in the heterologous cells intercellular adhesion experiment; D.adhered cells of shRNA-NC group in theheterologous cells intercellular adhesion experiment(fluorescence microscopes)

圖3 不同處理組SMMC- 7721細(xì)胞同種及異種黏附力

*P<0.05 compared with shRNA-NC group and blank group.

表3 不同處理組SMMC- 7721細(xì)胞異種黏附率

*P<0.05 compared with shRNA-NC group and blank group.

A.blank group; B.shRNA-NC group; C.shRNA-Gli2 group

*P<0.05 compared with shRNA-NC group and blank group

3 討論

Shh信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、組織極性、細(xì)胞分化及組織修復(fù)中起重要作用，而在正常成熟組織中處于失活狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)Shh信號(hào)通路異常激活與消化道腫瘤的發(fā)生及惡性生物學(xué)特性的維持密切相關(guān)[4]。Glis是該通路的終末轉(zhuǎn)錄因子[7],因此Gli2作為該通路的主要效應(yīng)因子可直接反映通路的活性狀態(tài)[5]。EMT是實(shí)體腫瘤原發(fā)灶癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力的基礎(chǔ)。細(xì)胞發(fā)生EMT包括細(xì)胞骨架重構(gòu)，細(xì)胞極性消失，細(xì)胞之間的同種黏附力下降，運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，從而發(fā)生轉(zhuǎn)移。EMT與TGF-β、Wnt/β-catenin和PI3K/AKT等信號(hào)通路相關(guān)[8- 9]。Gli2可與上訴信號(hào)通路交互作用影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展及惡性生物學(xué)特性[10- 12],但Gli2是否作為Shh信號(hào)通路的主要活化物通過EMT影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移尚未有相關(guān)報(bào)道。

為了探討Gli2對(duì)肝癌細(xì)胞EMT及轉(zhuǎn)移能力的影響及其機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)4株細(xì)胞系中Gli2的表達(dá)和侵襲能力。結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞系的侵襲能力明顯高于非腫瘤肝細(xì)胞系，且隨著肝癌細(xì)胞系侵襲能力的增強(qiáng),Gli2的表達(dá)逐漸增高。提示Gli2可能與肝癌的分化侵襲密切相關(guān)。用SMMC- 7721細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系。本研究利用RNAi技術(shù)，合成含shRNA-Gli2的慢病毒沉默SMMC- 7721細(xì)胞中Gli2基因，并檢測(cè)EMT標(biāo)志分子E-cadherin、N-cadherin、vimentin基因和蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示Gli2沉默后，上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin的表達(dá)水平顯著增高而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子N-cadherin及vimentin表達(dá)水平降低，提示SMMC- 7721細(xì)胞發(fā)生了“鈣粘蛋白轉(zhuǎn)換”即EMT發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。接著侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Gli2基因沉默后SMMC- 7721細(xì)胞的侵襲能力比對(duì)照組明顯降低。為進(jìn)一步揭示沉默Gli2導(dǎo)致侵襲能力下降的原因，實(shí)施了細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn),Gli2基因沉默后的SMMC- 7721細(xì)胞同種粘附能力增加、異種粘附能力降低。結(jié)合細(xì)胞侵襲、粘附能力的改變及E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表達(dá)變化情況，推測(cè)Gli2可能作為shh信號(hào)通路的主要轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控腫瘤細(xì)胞EMT。

綜上所述，下調(diào)Gli2的表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，為臨床肝細(xì)胞肝癌靶向的基因特異性治療提供了理論依據(jù)。

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The reverse effect ofGli2 gene silencing on epithelial- mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma cell line SMMC- 7721

DENG Da-wei1, KONG Xian-bing1*, WANG Ping1, YU Qing-san1, WANG Qiang2

(1.Dept. of Hepatobiliary Surgery; 2.Dept. of Gastrointestinal Surgery,the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

Objective To explore the effect and mechanism ofGli2 on EMT and invasion in the hepatocellular carcinoma cell line SMMC- 7721. Methods shRNA ofGli2 and Negative control (NC) shRNA were constructed and transfected into SMMC- 7721 cells. shRNA-Gli2 group,shRNA-NC group and blank group were set up.Transwell chambers assay, adhesion experiments were used to detect the ability of invasion,homogeneous and heterogeneous cells intercellular adhesion of each group. Meanwhile,the qRT-PCR,Western blot were used to examineGli2,E-cadherin,N-cadherin and vimentin mRNA and protein expression. Results In different hepatocellular carcinoma cell lines and be along with the increasing ability of the invasion in hepatocellular carcinoma cell lines,Gli2 expression was higher. Compared with the shRNA-NC group and blank control group,the interfered group extensive cells invasion ability was inhibited(P<0.05), homogeneous cells intercellular adhesion increased and heterogeneous cells intercellular was opposite(P<0.05),meanwhile,the expression of E-cadherin was declined significantly(P<0.05),the expression of N-cadherin,vimentin raised significantly(P<0.05). Conclusions SilencingGli2 gene can reverse the EMT of the hepatocellular carcinoma cell line SMMC- 7721 and inhibit cell invasion,its mecha-

nism may be related to the up-regulation of E-cadherin and the dow N-regulation of N-cadherin, vimentin.

Gli2;epithelial-mesenchymal transition(EMT);SMMC- 7721 cell;invasion;adhesion

2014- 07- 30

2014- 09- 29

重慶市科技攻關(guān)項(xiàng)目(9902200426-0001)

1001-6325(2015)01-0054-06

R735.7

A

*通信作者(corresponding author)：425995290@qq.com