改良抗酸染色法對兒童結(jié)核性腦膜炎診斷價值分析

曹曉娜，邵艷新，高 卿，蘇 一，魏 媛，馮建純

(1.辛集市第一人民醫(yī)院 兒科，河北 辛集 052360;2.河北省胸科醫(yī)院 檢驗科，河北 石家莊 050000)

結(jié)核性腦膜炎(結(jié)腦)是由于結(jié)核分枝桿菌(結(jié)核菌)侵犯腦膜引起的非化膿性炎癥，是最嚴(yán)重的結(jié)核病，約占肺外結(jié)核病的6%，預(yù)后較差，病死率高達15% ～30%，誤診率高［1］，存活者可遺留不同程度的后遺癥，如智力低下和(或)運動障礙等［2］。通過抗酸染色或培養(yǎng)在腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)中發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌是明確結(jié)腦診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”［3］。但是離心涂片法的陽性率很低，培養(yǎng)法所需時間一般在4～8周左右，很多患者由于不能及時確診而延誤治療。在2013年5月～2015年2月期間，我們共對30例臨床診斷為結(jié)腦的兒童的腦脊液標(biāo)本分別用BACTEC MGIT 960培養(yǎng)法、改良抗酸染色法［4－5］、離心涂片法進行檢測，探討改良抗酸染色法對兒童結(jié)腦的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 本組30份CSF標(biāo)本均取自辛集市第一人民醫(yī)院2013年5月～2015年2月按臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］診斷為結(jié)腦的兒童，其中男童17人，女童13人，年齡11個月～14歲，平均(7.8±1.5)歲，按送檢先后納入實驗，均為有腦膜刺激征后初次送檢的CSF。

1.2 臨床特點 30例患者中，浸潤型肺結(jié)核11例，合并血行播散型肺結(jié)核14例，骨結(jié)核3例，頸腋下淋巴結(jié)結(jié)核2例。臨床癥狀以不同程度的發(fā)熱、惡心、嘔吐、盜汗、食欲不振、驚厥、煩躁、癱瘓、頸強直、視力障礙為主要表現(xiàn)，頭顱影像學(xué)檢查異常者29例。

1.3 腦脊液其他檢查 顱壓升高28例;白細胞數(shù)升高并且為以嗜中性粒細胞為主的混合細胞學(xué)反應(yīng)30例;蛋白定量為0.45～2.0 g/L者27例，＞2.0 g/L 3例;糖定量＜2.5 mmol/L 29例，正常1例;氯化物＜120 mmol/L者29例，正常1例。

1.4 材料 玻片離心沉淀儀(Thermo Cytospin4型);BD公司BACTEC MGIT 960全自動結(jié)核菌快速鑒定儀;低溫離心機;抗酸染色液;培養(yǎng)箱等。

1.5 檢測方法

1.5.1 BACTEC MGIT 960培養(yǎng)法 取2 mL混勻的無菌CSF加入無菌離心管中，以3000 r/min低溫離心15 min，小心將上清液盡量多地倒入含有消毒劑的容器中，加入0.5 mL的PBS混勻。將營養(yǎng)添加劑Growth Supplement倒入雜菌抑制劑PANTA試劑瓶，充分混勻，然后加入到MGIT液體培養(yǎng)管中，每管0.8 mL，最后加入0.5 mL標(biāo)本進行培養(yǎng)。儀器報告陽性后取出行抗酸染色確認，陰性結(jié)果直接記錄。

1.5.2 離心涂片法 取2 mL CSF加入一次性塑料管中，以3000 r/min低溫離心15 min，輕輕棄掉上清液，吹打混勻試管底部沉渣進行涂片，火焰固定后，滴加石炭酸復(fù)紅染液，染色10 min，3%鹽酸酒精脫色1 min，美藍復(fù)染0.5 min，水洗，自然干燥，然后用油鏡檢查并記錄結(jié)果。詳細內(nèi)容參照《痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊》［7］。

1.5.3 改良抗酸染色法 取0.5 mL混勻的 CSF加入Cytospin-4型玻片離心沉淀儀中，以450 r/min離心5 min(玻片用多聚賴氨酸處理)，取出玻片干燥后抗酸染色，油鏡鏡檢。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 分別計算3種方法的陽性率，采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析，陽性率比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSF結(jié)核菌培養(yǎng) 30例CSF結(jié)核菌培養(yǎng)陽性4例，陽性率13.3%，細菌的初生長時間為28～45 d。CSF的性狀與培養(yǎng)陽性率直接相關(guān)，4例毛玻璃樣混濁的CSF結(jié)核菌培養(yǎng)完全陽性。

2.2 改良抗酸染色法與BACTEC MGIT 960培養(yǎng)法、離心涂片法檢測結(jié)果比較 30例CSF標(biāo)本中，改良抗酸染色法陽性17例，陽性率56.7%，改良抗酸染色法明顯高于BACTEC MGIT 960培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (配對 χ2=11.05，P ＜0.005，表 1);離心涂片法陽性1例，陽性率3.33%，改良抗酸染色法明顯高于離心涂片法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(配對 χ2=14.07，P ＜0.005，表2)。

表1 改良抗酸染色法與BACTEC MGIT 960培養(yǎng)法檢測結(jié)果比較

表2 改良抗酸染色法與離心涂片法檢測結(jié)果比較

2.3 預(yù)后 根據(jù)患兒的年齡、體質(zhì)量、身體狀況、病情嚴(yán)重程度及肝、腎功能，給予HRZ/HRZS方案抗結(jié)核治療，同時應(yīng)用糖皮質(zhì)激素減少炎性滲出、甘露醇降顱壓等對癥治療，30例患者中有25例好轉(zhuǎn)，好轉(zhuǎn)率為83.3%;3例因病情危重放棄治療;另2例治療無效死亡，離心涂片陽性的患者最早死亡。出院1年后隨訪，放棄治療3例均死亡，總病死率為16.7%。

3 討論

隨著結(jié)核病疫情的回升，成人結(jié)核病的增加引起兒童結(jié)核病增多現(xiàn)象十分明顯。我國第四次結(jié)核流行病學(xué)抽樣調(diào)查顯示0～14歲兒童結(jié)核感染率為9%，感染人數(shù)約為2608.1萬［8］。兒童結(jié)腦在小兒結(jié)核病中最為嚴(yán)重，由于兒童免疫力低，結(jié)腦癥狀特異性差，診斷困難，易誤診誤治，造成不良后果甚至死亡。兒童結(jié)腦的早期診斷十分重要，如能早期診斷及合理治療，則可降低致殘率和病死率［9］。目前，臨床醫(yī)生主要以CSF培養(yǎng)、抗酸染色、免疫學(xué)、PCR、常規(guī)和生化等檢測結(jié)果作為結(jié)核菌感染的診斷指標(biāo)，其中病原學(xué)檢查是診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其常用方法是培養(yǎng)法和離心涂片抗酸染色鏡檢法。

結(jié)核菌培養(yǎng)常采用改良羅氏培養(yǎng)法，一般需要4～8周，培養(yǎng)周期長，不利于早期診斷，BACTEC MGIT 960培養(yǎng)法雖較改良羅氏培養(yǎng)法快速，但也在1個月左右，由于腦脊液中結(jié)核菌數(shù)量極小，此法的檢出時間未見明顯縮短。離心涂片抗酸染色鏡檢法雖然簡便、經(jīng)濟、設(shè)備要求低，但是其檢出限位5000～10 000條/mL結(jié)核菌才能被檢出，檢出率極低，一般在0～10%。腦脊液中結(jié)核菌有兩個特點，數(shù)量極少、密度小于水的密度，以致難以通過離心完全沉淀。上述兩種方法都用到了離心的步驟，此步驟目的是濃集結(jié)核菌，但是在此過程中造成了本來就數(shù)量極少的結(jié)核菌的進一步丟失，其主要原因有:①結(jié)核菌密度小，在靜置情況下往上漂浮，很難通過離心使結(jié)核菌完全沉淀到管底，在棄掉上清時引起丟失。②巨大離心力使得本來量就很少的結(jié)核菌緊緊地貼在管壁，很難完全吹打下來，在轉(zhuǎn)移的過程中造成丟失。③在抗酸染色的過程中，需要幾次水洗，部分結(jié)核菌會掉下來。改良抗酸染色法應(yīng)用了Cytospin玻片離心沉淀儀，它有效地克服了離心過程的缺點，在甩片過程中，液體成分被濾紙吸收，結(jié)核菌直接沉淀在玻片上，沒有棄上清和轉(zhuǎn)移損失的問題，有形成分沉淀面積(直徑6 mm)遠遠小于涂片法，實現(xiàn)了濃集的目的。改良抗酸染色法設(shè)備較簡單，價格低，一份標(biāo)本檢測時間只需30 min。本研究中，此法較BACTEC MGIT 960培養(yǎng)法和離心涂片法具有明顯的差異性。

綜上所述，改良抗酸染色法快速、簡便、高效、經(jīng)濟、便捷、診斷兒童結(jié)腦陽性率高，有助于早期診斷，值得臨床推廣應(yīng)用。

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