蟾蜍令靈對裸鼠食管鱗癌原位移植瘤中P70S6K表達的影響

陳硯凝，劉 堯，王小玲，李 芳，劉月平

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·論著 ·

蟾蜍令靈對裸鼠食管鱗癌原位移植瘤中P70S6K表達的影響

陳硯凝，劉 堯，王小玲，李 芳，劉月平

背景 食管癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，近年研究發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白S6激酶(P70S6K)與其發(fā)生密切相關(guān)。筆者前期的研究表明，蟾蜍令靈(Bufalin)有明顯的抗腫瘤作用。目的 探討B(tài)ufalin對裸鼠食管鱗癌原位移植瘤中P70S6K表達的影響。方法 Nu/Nu健康裸鼠36只，雌雄各半，采用隨機數(shù)字表法分為4組，每組9只，即對照組(0.9%氯化鈉溶液)、Bufalin低劑量(0.5 mg/kg，BL)組、Bufalin中劑量(1.0 mg/kg，BM)組、Bufalin高劑量(1.5 mg/kg，BH)組。觀察經(jīng)Bufalin治療后裸鼠腫瘤生長情況；反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測裸鼠原位移植瘤中P70S6K mRNA的表達，Western blotting及免疫組化法檢測裸鼠原位移植瘤中P70S6K和p-P70S6K相對表達量。結(jié)果 4組治療前及治療后第1天裸鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4組治療前腫瘤體積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后第15天腫瘤體積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療后第15天，BM組、BH組腫瘤體積均低于BL組和對照組(P<0.05)。3組腫瘤抑制率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4組P70S6K mRNA及P70S6K相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.634、0.119，P>0.05)。4組p-P70S6K相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=233.005，P<0.05)。結(jié)論 Bufalin對裸鼠食管鱗癌原位移植瘤具有抑制作用；Bufalin可以下調(diào)P70S6K的磷酸化水平，而P70S6K則不受影響，提示Bufalin可能通過抑制P70S6K活化而發(fā)揮作用。

食管腫瘤；蟾蜍令靈；核糖體蛋白質(zhì)S6激酶類,70-kDa ；原位移植瘤

陳硯凝，劉堯，王小玲，等.蟾蜍令靈對裸鼠食管鱗癌原位移植瘤中P70S6K表達的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(15)：1763-1767.[www.chinagp.net]

Chen YN,Liu Y,Wang XL,et al.Effects of Bufalin on P70S6K in orthotopic transplanted tumor of esophageal squamous cell carcinoma in nude mice[J].Chinese General Practice，2015，18(15)：1763-1767.

食管癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，核糖體蛋白S6激酶(P70S6K)與其發(fā)生密切相關(guān)。P70S6K是磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物西羅莫司靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)通路下游的關(guān)鍵蛋白。筆者前期研究表明，蟾蜍令靈(Bufalin)有明顯的抗腫瘤作用[1]。本研究通過體內(nèi)給裸鼠接種食管鱗癌細胞株Eca-109，形成原位移植瘤，完整剝除瘤體，通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測PI3K/AKT/mTOR通路中P70S6K mRNA的表達水平，Western blotting法和免疫組化(SP)法檢測裸鼠原位移植瘤中P70S6K和p-P70S6K在食管鱗癌中的表達，探討B(tài)ufalin的抗腫瘤作用，闡明P70S6K與食管癌的相關(guān)性，為臨床應(yīng)用于食管癌的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株 食管鱗癌細胞株Eca-109由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供。

1.1.2 實驗動物 Nu/Nu健康裸鼠36只，雌雄各半，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購買，許可證號：SCXK(京)2012-0001，由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實驗動物中心專人飼養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，Bufalin(上海源葉生物技術(shù)有限公司)，P70S6K上下游引物〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕，兔抗人P70S6K單克隆抗體、兔抗人p-P70S6K單克隆抗體(美國Epitomics公司)，蘇木素、伊紅(北京中杉金橋生物科技公司)。

1.1.4 主要儀器 二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(日本三洋公司)，倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)，Alpha Innotech紫外凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha公司)，Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國Licor公司)，RM2135石蠟切片機、全自動免疫組化機(德國Leica公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng) 將Eca-109接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。

1.2.2 裸鼠食管鱗癌原位移植瘤模型的建立及分組 將Eca-109細胞懸液注射到裸鼠右側(cè)腋部皮下，0.2 ml/只，共接種36只，飼養(yǎng)約15 d，采用隨機數(shù)字表法分為4組，每組9只，即對照組(0.9%氯化鈉溶液0.2 ml，1次/d)、Bufalin低劑量(0.5 mg/kg，BL)組、Bufalin中劑量(1.0 mg/kg，BM)組、Bufalin高劑量(1.5 mg/kg，BH)組，腹腔注射給藥30 d。給藥結(jié)束后處死裸鼠，取約0.5 cm3的瘤體迅速放入-80 ℃冰箱中，用于RT-PCR和Western blotting，其余瘤體用于HE染色和SP染色，放入甲醛溶液中固定。

1.2.3 Bufalin對裸鼠體質(zhì)量、腫瘤體積及腫瘤抑制率的影響 記錄治療前及治療后第1天裸鼠體質(zhì)量變化。治療前直接測量腫瘤體積；治療后第15天將裸鼠全部處死，完整剝除瘤體，測量腫瘤長徑(a)，短徑(b)，計算腫瘤體積(ab2/2)和腫瘤抑制率〔(對照組平均腫瘤體積-治療組平均腫瘤體積)/對照組平均腫瘤體積×100%〕。

1.2.4 各組裸鼠原位移植瘤HE染色形態(tài)學(xué)觀察 將蠟塊切成4 μm切片，蘇木素染色3 min，1%鹽酸乙醇分化，1%稀氨溶液返藍5 s，伊紅染色1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，根據(jù)壞死范圍對各組進行劃分，即點狀壞死、灶狀壞死、大片狀壞死。

1.2.5 RT-PCR法主要步驟 取20～50 mg新鮮癌組織，用Trizol一步法提取總RNA，定量后取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。P70S6K引物經(jīng)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)驗證，以β-actin為內(nèi)參基因。P70S6K擴增產(chǎn)物長度為188 bp：上游引物：5＇-TACTTCGGGTACTTGGTAA-3＇，下游引物：5＇-GATGAAGGGATGCTTTACT-3＇，β-actin擴增產(chǎn)物長度為275 bp：上游引物：5＇-TACCTCATGAAGATCCTCACC-3＇，下游引物：5＇-TTTCGTGGATGCCACAGGAC-3＇。P70S6K反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 45 s、48 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min(共37 個循環(huán))，最后72 ℃延伸5 min。于 Alpha Innotech紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并進行灰度值掃描。相對表達量=目的基因灰度值/β-actin灰度值。

1.2.6 Western blotting法檢測原位移植瘤中P70S6K、p-P70S6K表達水平 取約30 mg新鮮癌組織冰上研磨，加入300 μl蛋白裂解液和2 μl蛋白酶抑制劑(PMSF)，4 ℃條件下以12 000 r/min離心15 min(離心半徑8 cm)，取上清液放入新的離心管(EP管)中，用蛋白質(zhì)定量-BCA(二辛可酸)法測定蛋白水平。取50 μg蛋白質(zhì)95 ℃金屬浴變性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。TBST稀釋的一抗P70S6K、p-P70S6K(1∶2 000)，4 ℃搖床過夜。TBST洗膜3次后放入稀釋的紅外標記的熒光二抗(1∶10 000)，室溫搖床反應(yīng)2 h。TBST洗膜3次后于Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)中采集圖像并分析，測定灰度值。

1.2.7 SP法檢測原位移植瘤中P70S6K、p-P70S6K的表達 將蠟塊做成4 μm切片，按照ElivisionTM免疫組化試劑盒說明書操作，DAB顯色后顯微鏡下觀察。結(jié)果判定：P70S6K、p-P70S6K定位于細胞膜或細胞質(zhì)，隨機選取40倍鏡下不少于10個視野，按照染色強度和陽性細胞所占的百分比進行分析。染色強度：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；陽性細胞所占百分比：0分為陰性，1分為陽性細胞所占百分比<10%，2分為陽性細胞所占百分比11%～50%，3分為陽性細胞所占百分比51%～75%，4分為陽性細胞所占百分比>75%。染色強度與陽性細胞所占百分比乘積：0～12分。

2 結(jié)果

2.1 原位移植瘤裸鼠體質(zhì)量、腫瘤體積及Bufalin對腫瘤抑制率的影響 4組治療前及治療后第1天裸鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。4組治療前腫瘤體積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后第15天腫瘤體積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療后第15天，BM組、BH組腫瘤體積均低于BL組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。BL組腫瘤抑制率為4.1%、BM組為37.6%、BH組為60.1%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.750,P<0.05)。

2.2 4組裸鼠原位移植瘤形態(tài)學(xué)比較 顯微鏡下觀察HE染色切片，裸鼠原位移植瘤的瘤組織呈低分化鱗狀細胞癌，癌細胞異形性明顯，核大深染，細胞形態(tài)多樣，排列成大小不等的實性巢，核染色質(zhì)呈粗顆粒狀，核仁明顯，少見細胞間橋及角化。對照組瘤組織無壞死或偶見點狀壞死，BL組瘤組織可見點狀壞死，BM組瘤組織以灶狀壞死為主，BH組瘤組織可見大片狀壞死灶(見圖1)。

表1 4組裸鼠體質(zhì)量、腫瘤體積比較±s)

注：BL=蟾蜍令靈低劑量，BM=蟾蜍令靈中劑量，BH=蟾蜍令靈高劑量；與對照組比較，*P<0.05；與BL組比較，△P<0.05

2.3 Bufalin對裸鼠原位移植瘤中P70S6K mRNA相對表達量的影響 RT-PCR結(jié)果顯示：對照組、BL組、BM組、BH組的P70S6K mRNA相對表達量分別為(0.831±0.070)、(0.858±0.043)、(0.859±0.050)、(0.841±0.043)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.634，P>0.05，見圖2)。

2.4 Bufalin對裸鼠原位移植瘤中P70S6K和p-P70S6K相對表達量的影響 Western blotting結(jié)果顯示：對照組、BL組、BM組、BH組的P70S6K相對表達量分別為(0.788±0.020)、(0.790±0.014)、(0.787±0.015)、(0.790±0.020)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.119，P>0.05)。對照組、BL組、BM組、BH組的p-P70S6K相對表達量分別為(1.203±0.057)、(1.153±0.061)、(0.852±0.072)、(0.611±0.037)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=233.005，P<0.05，見圖3)。

2.5 SP法檢測Bufalin對裸鼠原位移植瘤細胞P70S6K、p-P70S6K蛋白表達的影響 顯微鏡下觀察P70S6K、p-P70S6K染色強度與陽性細胞所占百分比：對照組、BL組、BM組、BH組的染色強度與陽性細胞所占百分比乘積分別為(8.3±0.5)、(7.8±1.5)、(8.5±0.5)、(8.2±0.4)分，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.500，P>0.05，見圖4)。對照組、BL組、BM組、BH組的p-P70S6K染色強度與陽性細胞所占百分比乘積分別為(11.0±1.5)、(9.7±1.9)、(6.7±1.0)、(3.5±0.6)分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=62.852，P<0.05，見圖5)。

3 討論

Bufalin是從傳統(tǒng)中藥蟾酥中提取的一種抗腫瘤的主要成分，屬于強心苷類物質(zhì)[2]，具有抗腫瘤、利尿、強心、升高血壓、局部麻醉、抗感染、抗輻射、鎮(zhèn)咳、抑制Na+/K+-ATP酶等作用。Bufalin目前在食管癌中的研究較少，也尚無治療食管癌的報道。Krenn 等[2]研究認為,Bufalin是最有效的具有地高辛樣免疫活性的組成成分。Bufalin作為蟾酥的有效抗腫瘤成分之一，臨床上用于治療多種腫瘤[3]。Bufalin抗腫瘤的確切機制目前尚不清楚。Kang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，Bufalin能通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路進而抑制細胞膜上的Na+/K+-ATP酶活性來達到抗腫瘤目的。

本研究結(jié)果顯示，通過給予裸鼠不同的藥物治療后第15天，BM組、BH組腫瘤體積均低于BL組和對照組，提示BM組、BH組腫瘤生長速度減慢，BL組腫瘤生長減慢程度不明顯；BL組腫瘤抑制率低于BM組和BH組，提示Bufalin 在中、高劑量時能抑制腫瘤生長，低劑量時抑制腫瘤作用不明顯，Bufalin具有抗腫瘤作用。mTOR/P70S6K是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其與細胞增殖、細胞凋亡密切相關(guān)。PI3K/AKT/mTOR通路有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用[5]，其是通過影響其下游多種關(guān)鍵因子的活化狀態(tài)而發(fā)揮作用的。有研究表明，在人類食管癌細胞中細胞增殖和細胞周期相關(guān)蛋白(如cyclin B1和p27)[6-7]、細胞凋亡相關(guān)蛋白(如cIAP1和caspase-3)[8-9]和此通路下游關(guān)鍵蛋白(P70S6K、4EBP1)[10]均被PI3K/AKT/mTOR通路所調(diào)控。本研究中P70S6K是mTOR通路下游的一個重要關(guān)鍵因子，是mTOR直接作用的底物，可以促進蛋白質(zhì)的合成，mTOR可以使P70S6K磷酸化為p-P70S6K，p-P70S6K的翻譯活性高于P70S6K的100倍左右[11]，從而促進蛋白質(zhì)合成。本研究通過Western blotting和SP結(jié)果顯示，4組p-P70S6K相對表達量有差異，且隨著Bufalin劑量的增加，p-P70S6K的活化水平逐漸下降，而P70S6K相對表達量則無明顯變化，因此推測Bufalin可能是通過抑制mTOR/P70S6K通路抑制P70S6K的磷酸化和激活，以此來達到抑制腫瘤生長的目的。提示Bufalin抑制腫瘤生長的作用與mTOR/P70S6K通路有關(guān)，其可以下調(diào)P70S6K的磷酸化水平，而P70S6K則不受影響，提示Bufalin可能是通過抑制P70S6K活化而發(fā)揮作用，從而抑制裸鼠原位移植瘤的生長。本研究RT-PCR結(jié)果顯示，4組P70S6K mRNA相對表達量無差異，提示Bufalin可以阻斷P70S6K磷酸化為p-P70S6K。

注：1為對照組，2為BL組，3為 BM組，4為BH組

圖1 裸鼠原位移植瘤形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(HE染色，×200)

Figure 1 Tumor morphology of nude mouse transplantation

注：A為電泳圖，B為條圖；M為Marker，1為對照組，2為BL組，3為 BM組，4為BH組

圖2 4組裸鼠原位移植瘤中P70S6K mRNA的相對表達量比較

Figure 2 Comparison of relative expression of P70S6K mRNA in the four groups

注：A為電泳圖，B為條圖；1為對照組，2為BL組，3為 BM組，4為BH組；P70S6K=核糖體蛋白S6激酶；與對照組比較，*P<0.05；與BL組比較，△P<0.05

圖3 4組裸鼠原位移植瘤中P70S6K和p-P70S6K相對表達量比較

Figure 3 Comparison of relative expression of P70S6K and p-P70S6K in the four groups

注：1為對照組，2為BL組，3為 BM組，4為BH組

圖4 4組裸鼠原位移植瘤中P70S6K表達情況 (免疫組化法，×200)

Figure 4 The expression of P70S6K in the four groups of nude mouse transplantation

注：1為對照組，2為BL組，3為 BM組，4為BH組

圖5 4 組裸鼠原位移植瘤中p-P70S6K的表達情況 (免疫組化法，×200)

Figure 5 The expression of p-P70S6K in the four groups of nude mouse transplantation

綜上所述，通過研究Bufalin抑制P70S6K介導(dǎo)的食管癌發(fā)生發(fā)展的機制，提示Bufalin可能是通過抑制mTOR/P70S6K通路抑制P70S6K的磷酸化和激活，以此來達到抑制腫瘤生長的目的，為Bufalin在食管癌中的研究提供了新的資料，并且為以mTOR/P70S6K通路為靶點的抗腫瘤藥物治療食管癌提供新的理論依據(jù)。

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(本文編輯：李婷婷)

Effects of Bufalin on P70S6K in Orthotopic Transplanted Tumor of Esophageal Squamous Cell Carcinoma in Nude Mice

CHENYan-ning,LIUYao,WANGXiao-ling,etal.

DepartmentofPathology,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

Background Esophageal cancer is one of the most common gastrointestinal malignant tumors in the world.According to related studies in recent years,P70S6K is closely related to the occurrence of esophageal cancer.Some previous studies indicate that Bufalin has significant anti-tumor effect.Objective To investigate the effects of Bufalin on P70S6K in orthotopic transplanted tumor of esophageal squamous cell carcinoma in nude mice.Methods 36 Nu/Nu healthy nude mice (18 were male,and 18 were female) were euqally divided into four groups by random number table method:control group (treated with 0.9% sodium chloride solution),Bufalin low dose group (BL group,treated with 0.5 mg/kg Bufalin),Bufalin middle dose group (BM group,treated with 1.0 mg/kg Bufalin) and Bufalin high dose group (BH group,treated with 1.5 mg/kg Bufalin).The growth of xenografted tumors after Bufalin treatment was observed;the expression of P70S6K mRNA in transplanted tumor in nude mice was examined by RT-PCR method;the expression level of P70S6K and activation level of P70S6K in transplanted tumors of nude mice were detected by western blot and immunohistochemical methods.Results There was no significant difference in body weight of nude mice among four groups before treatment and one day after treatment (P>0.05).There was no significant difference in tumor volume among four groups before treatment (P>0.05);there was significant difference in tumor volume among four groups 15 days after treatment (P<0.05).Tumor volume of mice in BM group and BH group was significantly lower than that of mice in BL group and control group 15 days after treatment,respectively (P<0.05).There was significant difference in tumor inhibition ratio among three groups (P<0.05).There was no significant difference in relative expression levels of P70S6K mRNA and P70S6K among four groups (F=0.634,P>0.05).There was no significant difference in relative expression level of p-P70S6K among four groups (F=233.005，P<0.05).Conclusion Bufalin has an anti-tumor effect on the orthotopic transplanted tumor of esophageal squamous cell carcinoma in nude mice；Bufalin can decrease the level of P70S6K phosphorylation,while P70S6K is not affected,which suggests that Bufalin may inhibit tumor growth through inhibiting the activation of P70S6K.

Esophageal neoplasms；Bufalin；Ribosomal protein S6 kinases,70-kDa;Orthotopic transplanted tumor

國家自然科學(xué)基金資助項目(81303271)

050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科

劉月平，050011河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院病理科；E-mail：annama@163.com

R 735.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.15.007

2014-12-21；

2015-03-13)