毒毛旋花子阿洛糖苷誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞SGC-7901凋亡作用及機(jī)制研究

張雪嬌，梅文莉，蔡彩虹，董文化，姜 北，黃風(fēng)迎，戴好富

?

·論著·

毒毛旋花子阿洛糖苷誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞SGC-7901凋亡作用及機(jī)制研究

張雪嬌，梅文莉，蔡彩虹，董文化，姜 北，黃風(fēng)迎，戴好富

目的 探討毒毛旋花子阿洛糖苷誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞SGC-7901凋亡作用及其機(jī)制。方法 將人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901分為對(duì)照組、0.125 μg/ml組、0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組，四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)檢測(cè)毒毛旋花子阿洛糖苷對(duì)胃腺癌細(xì)胞SGC-7901的生長(zhǎng)抑制作用，Hoechst染色和Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位變化，Western blotting法檢測(cè)線粒體途徑相關(guān)蛋白細(xì)胞色素C、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示，24 h和48 h時(shí)不同組胃腺癌細(xì)胞SGC-7901吸光度(A)、生長(zhǎng)抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；組間兩兩比較胃腺癌細(xì)胞SGC-7901 A值依次降低、生長(zhǎng)抑制率依次升高(P<0.05)。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞核顯示為藍(lán)熒光且較均勻，0.500 μg/ml組處理12 h后細(xì)胞核呈緊密較亮熒光體，顏色較白。不同組胃腺癌細(xì)胞SGC-7901總相對(duì)死亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；組間兩兩比較胃腺癌細(xì)胞SGC-7901總相對(duì)死亡率依次升高(P<0.05)。JC-1染色結(jié)果顯示，毒毛旋花子阿洛糖苷處理胃腺癌細(xì)胞SGC-7901 12 h后，0.125 μg/ml組、0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組顯示綠色熒光，隨毒毛旋花子阿洛糖苷濃度的增加綠色熒光增強(qiáng)。Western blotting法顯示，隨著細(xì)胞凋亡的發(fā)生，細(xì)胞色素C從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中，同時(shí)，Caspase-3和Caspase-9也被激活并發(fā)生剪切活化，活化片段表達(dá)增加。結(jié)論 毒毛旋花子阿洛糖苷通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901凋亡。

胃腫瘤；毒毛旋花子甙類；線粒體；細(xì)胞凋亡

張雪嬌，梅文莉，蔡彩虹，等.毒毛旋花子阿洛糖苷誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞SGC-7901凋亡作用及機(jī)制研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(15)：1743-1747.[www.chinagp.net]

Zhang XJ,Mei WL,Cai CH,et al.Apoptosis of gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 induced by Strophalloside and its mechanism[J].Chinese General Practice，2015，18(15)：1743-1747.

見血封喉為?？埔娧夂韺?Antiracism)植物，別名箭毒木，主要分布于東南亞，我國僅產(chǎn)1種，分布于海南、云南等地，其鮮樹汁乳白色，有劇毒，民間入藥用于強(qiáng)心、催吐、瀉下、麻醉等。研究表明，見血封喉乳汁和種子的主要成分為強(qiáng)心苷類化合物，具有強(qiáng)心作用[1-3]。為開發(fā)熱帶藥用植物資源，在活性篩選指導(dǎo)下，本實(shí)驗(yàn)室從海南產(chǎn)見血封喉的乙醇提取物中分離出一系列強(qiáng)心苷，其中毒毛旋花子阿洛糖苷對(duì)胃腺癌細(xì)胞SGC-7901具有顯著的細(xì)胞毒活性[4-5]。長(zhǎng)期以來，強(qiáng)心苷在臨床上廣泛應(yīng)用于充血性心力衰竭以及其他心源性疾病的治療，研究也表明，強(qiáng)心苷對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞具有優(yōu)先選擇性殺傷作用，其機(jī)制包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等[6-8]。本研究探討毒毛旋花子阿洛糖苷對(duì)人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901是否具有誘導(dǎo)凋亡的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，RPMI Medium 1640培養(yǎng)基購于Solarbio公司，胎牛血清(PBS)購于四季青生物工程材料有限公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Hoechst染色試劑盒(Hoechst Staining Kit)、線粒體分離試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞色素C抗體、Caspase-3抗體、Caspase-9抗體、環(huán)氧酶(COX)Ⅳ抗體、肌動(dòng)蛋白(Actin)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901培養(yǎng)于含10%磷酸鹽緩沖液(PBS)的RPMI Medium 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化常規(guī)傳代。

1.3 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)檢測(cè)毒毛旋花子阿洛糖苷對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 將人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901分為對(duì)照組、0.125 μg/ml組、0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，向每孔加10 μl的藥液，每組設(shè)定6個(gè)平行孔，毒毛旋花子阿洛糖苷濃度分別為0、0.125、0.250、0.500、1.000 μg/ml，置于37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在24 h和48 h后，棄上清液，向每孔加100 μl二甲基亞砜(DMSO)，搖床震蕩10 min后，酶標(biāo)儀(Bio-Tek,ELX808IU)檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處吸光度(A)，按公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率，生長(zhǎng)抑制率(%)=〔1-(實(shí)驗(yàn)組均值/對(duì)照組均值)〕×100%。

1.4 Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將潔凈蓋玻片置于6孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)過夜，孔中細(xì)胞50%～80%時(shí)，加入毒毛旋花子阿洛糖苷，濃度為0.500 μg/ml，24 h后，棄培養(yǎng)基，加0.5 ml固定液固定10 min，去固定液，用PBS洗滌2次，棄上清液，加入0.5 ml Hoechst 33258染色液染色5 min，去染色液，用PBS洗滌2次，將蓋玻片蓋到滴有抗熒光淬滅封片液的載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察。對(duì)比觀察對(duì)照組、0.500 μg/ml組的染色結(jié)果。

1.5 Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 對(duì)照組、0.125 μg/ml組、0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃腺癌細(xì)胞SGC-7901接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，加藥處理24 h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌2次，用195 μl的Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞后，加5 μl的Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min，1 000×g離心5 min，棄上清液，用190 μl的Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞后，加10 μl PI染色液，輕輕混勻，避光4 ℃孵育5 min。然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)總相對(duì)死亡率。

1.6 JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位 對(duì)照組、0.125 μg/ml組、0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃腺癌細(xì)胞SGC-7901接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，加藥處理12 h后，棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌1次，棄PBS，每孔加1 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液和1 ml的JC-1染色工作液，混勻于37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。然后棄上清液，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，棄上清液，加2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液于熒光顯微鏡下觀察。

1.7 Western blotting 法檢測(cè)線粒體蛋白表達(dá) 線粒體蛋白的提取使用細(xì)胞線粒體分離試劑盒，收集0.500 μg/ml組的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，棄PBS，向細(xì)胞沉淀里添加已加入苯甲基磺酰氟(PMSF)的線粒體分離試劑，重懸后把細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到適當(dāng)大小的玻璃勻漿器中，勻漿30下，600×g，4 ℃離心10 min，把上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管，11 000×g，4 ℃離心10 min，沉淀即為細(xì)胞線粒體，加線粒體裂解液得線粒體蛋白，同時(shí)上清液12 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液為細(xì)胞質(zhì)蛋白。用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測(cè)定蛋白表達(dá)，以60 μg的上樣量對(duì)蛋白進(jìn)行變性，用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液下進(jìn)行蛋白分離，細(xì)胞色素C抗體按1∶200一抗稀釋液稀釋，一抗Caspase-3抗體按1∶250一抗稀釋液稀釋，Caspase-9、COX Ⅳ、Actin抗體均按1∶1 000一抗稀釋液稀釋，用辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶1 000)封閉，用增強(qiáng)型化學(xué)免疫印跡檢測(cè)系統(tǒng)(ECL)檢測(cè)免疫反應(yīng)蛋白。

2 結(jié)果

2.1 不同組胃腺癌細(xì)胞SGC-7901 A值、生長(zhǎng)抑制率比較 MTT法結(jié)果顯示，24 h和48 h時(shí)不同組胃腺癌細(xì)胞SGC-7901 A值、生長(zhǎng)抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中24 h和48 h時(shí)，0.125 μg/ml組、0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組較對(duì)照組胃腺癌細(xì)胞SGC-7901 A值降低、生長(zhǎng)抑制率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組較0.125 μg/ml組胃腺癌細(xì)胞SGC-7901 A值降低、生長(zhǎng)抑制率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；0.500 μg/ml組、1.000 μg/ml組較0.250 μg/ml組胃腺癌細(xì)胞SGC-7901 A值降低、生長(zhǎng)抑制率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1.000 μg/ml組較0.500 μg/ml組胃腺癌細(xì)胞SGC-7901 A值降低、生長(zhǎng)抑制率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2 細(xì)胞凋亡情況 細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，因?yàn)槿旧|(zhì)固縮，Hoechst 染色表現(xiàn)為細(xì)胞核呈緊密較亮熒光體并且顏色變白。在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞核顯示為藍(lán)熒光且較均勻，0.500 μg/ml組處理12 h后細(xì)胞核呈緊密較亮熒光體，顏色較白(見圖1)。處理24 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，采用Annexin V-FITC和PI染色后，正常的活細(xì)胞不被Annexin V-FITC和PI染色(左下角)；凋亡早期的細(xì)胞僅被Annexin V-FITC染色，PI染色呈陰性(右下角)；壞死細(xì)胞和凋亡晚期的細(xì)胞可以同時(shí)被Annexin V-FITC和PI染色(右上角)。左上角出現(xiàn)的是許可范圍內(nèi)的檢測(cè)誤差(見圖2)。不同組胃腺癌細(xì)胞SGC-7901總相對(duì)死亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中，0.125 μg/ml組、0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組較對(duì)照組胃腺癌細(xì)胞SGC-7901 總相對(duì)死亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組較0.125 μg/ml組胃腺癌細(xì)胞SGC-7901總相對(duì)死亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；0.500 μg/ml組較0.250 μg/ml組胃腺癌細(xì)胞SGC-7901總相對(duì)死亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

圖1 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況(Hoechst染色，×200)

Figure 1 The cell apoptosis under the fluorescence microscope

Table 1 Comparison of value A and rate of growth inhibition of human gastric cancer cells type SGC-7901 among different groups at 24 h and 48 h after treatment

組別 24hA值 生長(zhǎng)抑制率(%) 48hA值 生長(zhǎng)抑制率(%)對(duì)照組0920±0027000±0000975±0034000±0000125μg/ml組0855±0029?706±315?0890±0056?871±580?0250μg/ml組0782±0015?△1500±160?△0747±0040?△2338±423?△0500μg/ml組0675±0009?△▲2663±102?△▲0356±0012?△▲6256±131?△▲1000μg/ml組0465±0005?△▲☆4946±050?△▲☆0104±0005?△▲☆8933±057?△▲☆F值791886091016710475P值<0001<0001<0001<0001

注：A=吸光度；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與0.125 μg/ml組比較，△P<0.05；與0.250 μg/ml組比較，▲P<0.05；與0.500 μg/ml組比較，☆P<0.05

Table 2 Comparison of total relative mortality of gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 among different groups

組別總相對(duì)死亡率(%)對(duì)照組0000±0000125μg/ml組812±154?0250μg/ml組1125±243?△0500μg/ml組6024±1079?△▲F值11102P值<0001

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與0.125 μg/ml組比較，△P<0.05;與0.250 μg/ml組比較,▲P<0.05

注：PI=碘化丙啶

圖2 不同組Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

Figure 2 Detection of cell apoptosis in different groups using Annexin V-FITC/PI flow cytometry

2.3 線粒體膜電位改變 JC-1染色結(jié)果顯示，毒毛旋花子阿洛糖苷處理胃腺癌細(xì)胞SGC-7901 12 h后，0.125 μg/ml組、0.250 μg/ml組、0.500 μg/ml組顯示綠色熒光，隨毒毛旋花子阿洛糖苷濃度的增加綠色熒光增強(qiáng)(見圖3)。

2.4 Western blotting法檢測(cè)線粒體蛋白表達(dá) 分別提取毒毛旋花子阿洛糖苷(0.500 μg/ml)處理不同時(shí)間點(diǎn)的線粒體蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白，檢測(cè)細(xì)胞色素C、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)，結(jié)果顯示，隨著細(xì)胞凋亡的發(fā)生，細(xì)胞色素C從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中，同時(shí)，Caspase-3和Caspase-9也被激活并發(fā)生剪切活化，活化片段表達(dá)增加(見圖4)。

3 討論

胃癌是嚴(yán)重危害人們健康和生命的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率居各類腫瘤的首位[9]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。目前許多抗腫瘤的化療藥物主要通過誘導(dǎo)其凋亡來殺傷腫瘤細(xì)胞。

細(xì)胞凋亡是十分復(fù)雜的過程，是由基因精確調(diào)控的程序性死亡方式，盡管促進(jìn)凋亡的具體信號(hào)途徑尚未完全清楚，但是一些誘導(dǎo)分子最終均通過活化一系列被稱為半胱氨酸蛋白酶的信號(hào)分子參與的共同通路來誘導(dǎo)凋亡過程，從而最終導(dǎo)致DNA斷裂以及與凋亡相關(guān)的形態(tài)學(xué)改變[10-11]。目前,已知兩種信號(hào)途徑可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[12-15]：第一途徑即外部信號(hào)途徑亦稱死亡受體途徑，主要由Fas(CD95)死亡受體或其他腫瘤壞死因子α(TNF-α)受體超家族成員活化并募集細(xì)胞膜旁的Caspase (主要為Caspase-8)，然后活化Caspase-3，后者促進(jìn)細(xì)胞凋亡；第二種途徑指內(nèi)部途徑或稱線粒體途徑，其特點(diǎn)是線粒體級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，活化Caspase-9，并形成凋亡小體及多蛋白復(fù)合物，進(jìn)而活化下游Caspase-3，放大死亡信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。可見兩種途徑分別特異性活化Caspase-8或Caspase-9，兩種途徑最后均活化Caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。近年來人們對(duì)凋亡的認(rèn)識(shí)已經(jīng)從細(xì)胞核的改變決定凋亡發(fā)展為重視線粒體，因?yàn)槠錁?gòu)成了細(xì)胞存亡的控制中心。凋亡過程中線粒體呼吸鏈電子傳遞中斷，自由基產(chǎn)生，能量供應(yīng)受阻。在檢測(cè)到經(jīng)典的細(xì)胞凋亡特征以前，線粒體膜完整性就已發(fā)生了重大變化，這些變化涉及線粒體內(nèi)膜和外膜的改變，包括內(nèi)膜跨膜電位的喪失和蛋白質(zhì)通過外膜的釋放[16]。

圖3 JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位變化(JC-1染色，×200)

注：Cyto-C=細(xì)胞色素C，COX Ⅳ=環(huán)氧酶Ⅳ，Actin=肌動(dòng)蛋白

圖4 Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞色素C、Caspase-3 和Caspase-9的表達(dá)

Figure 4 Detection of expressions of cytochrome C,Caspase-3 and Caspase-9 by Western blotting analysis

強(qiáng)心苷類化合物已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于各種腫瘤的防治研究中,能通過多種途徑在體內(nèi)、外發(fā)揮抗腫瘤作用。毒毛旋花子阿洛糖苷是強(qiáng)心苷的一種。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毒毛旋花子阿洛糖苷處理胃腺癌細(xì)胞SGC-7901能夠明顯抑制其生長(zhǎng)和增殖，并能有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這種抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性，隨著時(shí)間及藥物濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率呈遞增趨勢(shì)。用JC-1染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)毒毛旋花子阿洛糖苷處理胃腺癌細(xì)胞SGC-7901線粒體膜電位明顯下降的同時(shí)，線粒體細(xì)胞色素C也逐漸下降，但細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞色素C的表達(dá)則明顯增加，說明細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，毒毛旋花子阿洛糖苷處理胃腺癌細(xì)胞SGC-7901后，Caspase-9和Caspase-3也活化，從而激活Caspase凋亡途徑，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果說明，毒毛旋花子阿洛糖苷可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞凋亡，是一種潛在的腫瘤治療的有效藥物。由于強(qiáng)心苷在大劑量應(yīng)用時(shí)具有心臟毒性,故安全性問題成為其投入抗癌臨床應(yīng)用的最大障礙。近期有報(bào)道通過對(duì)化合物結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，可以降低其毒性，同時(shí)保留抗腫瘤活性[8]，因此通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化把毒毛旋花子阿洛糖苷的抗腫瘤活性控制在非毒性范圍內(nèi)是一個(gè)亟待解決的問題。

[1]Gheorghiade M.Digoxin therapy in chronic heart failure [J].Cardiovasc Drugs Ther,1997,11(Suppl 1):279-283.

[2]Dai HF,Gan YJ,Que DM,et al.Two new cytotoxic cardenolides from the latex of Antiaris toxicaria [J].J Asian Nat Prod Res,2009,11(9):832-837.

[3]Mei WL,Gan YJ,Que DM,et al.Study on the chemical constituents from the latex of antiaris toxicaria[J].Chinese Journal of Organic Chemistry,2011,31(4):533-537.(in Chinese) 梅文莉,干玉娟,闕東枚,等.見血封喉乳汁中的化學(xué)成分研究 [J].有機(jī)化學(xué),2011,31(4):533-537.

[4]Que DM,Mei WL,Dai HF.Cytotoxic cardenolides from the latex of antiaris toxicaria[J].Journal of Tropical and Subtropcal Botany,2010,18(4):440-444.(in Chinese) 闕東枚,梅文莉,戴好富.見血封喉乳汁中具有細(xì)胞毒活性的強(qiáng)心苷[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào),2010,18(4):440-444.

[5]Dong WH,Mei WL,Zeng YB,et al.Cardenolides from the seeds of antiaris toxicaria and their cytotoxicity[J].Journal of Tropical and Subtropcal Botany,2011，19(2):171-176.(in Chinese) 董文化,梅文莉,曾艷波,等.見血封喉種子強(qiáng)心苷類化合物及其細(xì)胞毒活性[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2011，19(2):171-176.

[6]Packer M,Cohn JN.Consensus recommendations for the management of chronic heart failure.On behalf of the membership of the advisory council to improve outcomes nationwide in heart failure [J].Am J Cardiol,1999,83(2A):1A-38.

[7]Guo JL,Zheng SJ,Li YN,et al.Toxicarioside A inhibits SGC-7901 proliferation,migration and invasion via NF-κB/bFGF signaling [J].World J Gastroenterol,2012,18(14):1602-1609.

[8]Juncker T,Cerella C,Teiten MH,et al.UNBS1450,a steroid cardiac glycoside inducing apoptotic cell death in human leukemia cell [J].Biochem Pharmacol,2011,81(1):13-23.

[9]Sun XD,Mu R,Zhou YS,et al.Analysis of mortality rate of stomach cancer and its trend in twenty years in China [J].Chinese Journal of Oncology,2004,26 (1):4-9.(in Chinese) 孫秀娣，牧人,周有尚，等.中國胃癌死亡率20年變化情況分析及其發(fā)展趨勢(shì)預(yù)測(cè)[J].中華腫瘤雜志,2004,26 (1):4-9.[10]Yaguchi T,Fujikawa H,Nishizaki T.Linoleic acide derivative DCP-LA protects neurons from oxidative stress-induced apoptosis by inhbiting activation of caspase-3/-9 [J].Neurochemi Res,2010,35(5):712-717.

[11]Peter ME,Heufelder AE,Hengartner MO,et al.Advances in apoptosis research [J].Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94(24):12736-12737.

[12]Ashkenazi A,Dixit VM.Death receptor:signaling and modulation [J].Science,1998,281(5381):1305-1308.

[13]Crow MT,Mani K,Nam YJ,et al.The mitochondrial death pathway and cardiac myocyte apoptosis [J].Circ Res,2004,95(10)：957-970.

[14]Ma X,Zhang LH,Wang LR,et al.Single-walled carbon nanotubes alter cytochrome c electron transfer and modulate mitochondrial function [J].ACS Nano,2012,6(12):10486-10496.

[15]Jiang X,Wang X.Cytochrome C-mediated apoptosis [J].Annu Rev Biochem,2004,73:87-106.

[16]Norberg E,Orrenius S,Zhivotovsky B,et al.Mitochondrial regulation of cell death:processing of apoptosis-inducing factor (AIF) [J].Biochem Biophys Res Commun,2010,396(1):95-100.

(本文編輯：陳素芳)

Apoptosis of Gastric Adenocarcinoma Cells Type SGC-7901 Induced by Strophalloside and Its Mechanism

ZHANGXue-jiao,MEIWen-li,CAICai-hong,etal.

DaliUniversity,Dali671099,China

Objective To explore the apoptosis-inducing effect of Strophalloside on gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 and its mechanism.Methods The human gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 were divided into control group,0.125 μg/ml group,0.250 μg/ml group,0.500 μg/ml group,and 1.000 μg/ml group.The growth inhibition effect of Strophalloside on gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 was detected by MTT assay,and the apoptosis was measured by Annexin V-FITC/PI flow cytometry and Hoechst staining.The changes of mitochondrial membrane potential were examined by JC-1 kit.The expressions of mitochondrial pathway-related protein cytochrome C,Caspase-3 and Caspase-9 were detected by Western blotting analysis.Results According to MTT assay results,there were significant differences in value A and rate of growth inhibition of gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 among different groups at 24 h and 48 h after treatment,respectively (P<0.05);comparison of the above two indicators between groups showed that value A of gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 decreased sequentially,and rate of growth inhibition increased sequentially (P<0.05).By fluorescence microscope,the cell nucleus of control group showed homogeneous blue fluorescence,the cell nucleus of 0.500 μg/ml group showed compact bright fluorescence with white color.There was significant difference in total relative mortality of gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 among different groups (P<0.05);comparison of the above indicator between groups showed that total relative mortality of gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 increased sequentially (P<0.05).According to results of JC-1 staining,gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 showed green fluorescence 12 h after Strophalloside treatment,and fluorescence intensity increased as concentration of Strophalloside rised.According to Western blotting results,cytochrome C was released from mitochondria into cytoplasm C,and Caspase-3 and Caspase-9 were activated,shear and activation occurred,the expression level of activated fragments increased.Conclusion Strophalloside can induce apoptosis of gastric adenocarcinoma cells type SGC-7901 through the mitochondria-mediated pathway.

Stomach neoplasms；Strophanthins；Mitochondria；Apoptosis

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30860345)；國家科技支撐計(jì)劃課題資助項(xiàng)目(2013BAI11B04)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303117)

671099云南省大理市，大理學(xué)院(張雪嬌)；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所(梅文莉，蔡彩虹，董文化，戴好富)；大理學(xué)院藥物研究所(姜北)；海南醫(yī)學(xué)院海南省熱帶病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(黃風(fēng)迎)

黃風(fēng)迎，571101海南省海口市，海南醫(yī)學(xué)院海南省熱帶病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；E-mail：fyhuang16@126.com

戴好富，570100海南省?？谑?，中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所；E-mail：daihaofu@itbb.org.cn

R 735.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.15.003

2014-06-28；

2015-01-06)