響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取紫茄皮中花青素工藝

李 健，王金秋，劉 寧，黎晨晨

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150076)

茄子學(xué)名為Solanum melongenaL，是茄屬以漿果為果實(shí)的一年生草本植物，高60～80 cm，夏秋開(kāi)花結(jié)果，槳果呈球形、橢圓形，果皮多為紫紅色，栽培面積廣泛[1].茄子味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，不僅是蔬菜，還是一味中藥[2].茄子性味古寒，有消腫止疼、治療寒熱、祛風(fēng)通絡(luò)和止血等功效[3].茄子皮中含有大量花青素，屬于類黃酮物質(zhì)，是一類存在于植物中的水溶性色素，顏色隨著細(xì)胞液的酸堿不同而發(fā)生改變，使花辨和果實(shí)呈現(xiàn)五彩六色[4－5]，同時(shí)，花青素還是一種天然色素.研究表明:花青素具有很多生理活性，如抗氧化，可預(yù)防由氧化損傷所引起的糖尿病、心腦血管疾病、保護(hù)肝臟，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制炎癥過(guò)敏等活性[6－10].前人研究了茄子皮中色素的溶劑提取工藝[11－14]、微波輔助輔助提取工藝[15]及不同品種茄子果皮花青素含量及其穩(wěn)定性[16].本研究擬以廢棄的紫茄皮為原料，以花青素提取率為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面法得到回歸方程，分析得出相對(duì)安全、高效和簡(jiǎn)單的紫茄皮中花青素提取的最優(yōu)工藝，為茄子資源的充分利用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫茄子，購(gòu)于哈爾濱市家樂(lè)福超市.

矢車菊－3－O－葡萄糖苷(色譜純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)北京方程生物科技有限公司;無(wú)水乙醇、鹽酸、氯化鉀、檸檬酸、冰乙酸、無(wú)水乙酸鈉(均為分析純)天津市天力化學(xué)試劑廠.

1.2 儀器與設(shè)備

KQ－500VDED雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;EF－500搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司;LD4－2A低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠;DHG－9123電熱恒溫轉(zhuǎn)風(fēng)干燥箱，上海恒科有限公司;UV5100B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司;HWS24電子分析天平，上海恒科有限公司;HC－7P11－5架盤藥物天平，上海精科科技有限公司;TU－1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司.

1.3 方法

1.3.1 紫茄皮的預(yù)處理

紫茄子清洗干凈，取皮，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器50℃烘干，粉碎過(guò)40目篩，得到紫茄皮粉，4℃儲(chǔ)藏備用[17].

1.3.2 紫茄皮花青素提取工藝流程

紫茄皮粉→加入提取溶劑(乙醇)→45 Hz超聲波提取→離心(3 000 r/min，10 min)→上清液→花青素粗提液

1.3.3 測(cè)定方法

花青素含量的測(cè)定方法采用pH示差法[17－20].

其中:C為提取液中花青素的質(zhì)量濃度，mg/mL;V為提取液總體積，mL;N為提取液稀釋倍數(shù);M為樣品的初重，mg.

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1)測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

稱取矢車菊 －3－O－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，置于20.00 mL 刻度試管中，用 pH=1.0 體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解，定容至20.00 mL，配制成質(zhì)量溶度為50 μg/mL的溶液，即為花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液.取花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，適當(dāng)稀釋，在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定花青素對(duì)照品溶液的最大吸收峰.

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[21]

分別取 0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mL花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用pH=1.0的氯化鉀緩沖溶液定容至 5.00 mL;再分別取 0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 mL 花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用 pH=4.5的無(wú)水乙酸鈉緩沖溶液定容至5.00 mL.利用紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)及700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程.

3)紫茄皮花青素的定性實(shí)驗(yàn)

確稱取紫茄皮粉1.000 g，70 mL體積分?jǐn)?shù)70%pH=1.0乙醇溶液，40℃、400 W條件下超聲提取30 min，3 000 r/min離心10 min，得到上清液即為紫茄皮花青素提取液，取提取液適當(dāng)稀釋，在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定紫茄皮花青素的最大吸收峰.

1.3.5 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取七份紫茄皮粉各1.000 g，以紫茄皮中花青素的提取率作為評(píng)價(jià)花青素提取的標(biāo)準(zhǔn)，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(30%、40%、50%、60%、

取0.80 mL花青素粗提液，分別用 pH=1.0氯化鉀緩沖溶液和pH=4.5無(wú)水乙酸鈉緩沖溶液定容至25.00 mL，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在最大吸收峰和700 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)公式(1)計(jì)算花青素含量:70%、80%、90%)、液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1 mL/g)、提取時(shí)間(10、20、30、40、50、60、70 min)、超聲功率(200、250、300、350、400、450、500 W)對(duì)紫茄皮花青素提取率的影響.

1.3.6 Box－Behnken設(shè)計(jì)確定最佳提取條件

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)Design Expert軟件，根據(jù)Box－Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[22－24]，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，利用響應(yīng)面結(jié)果上確定紫茄皮中花青素的最佳提取條件中.響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1.

表1 響應(yīng)面分析因子與水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以矢車菊－3－O－葡萄糖苷為對(duì)照品，將其乙醇溶液繪制吸收曲線，得出在280 nm和510 nm波長(zhǎng)下均有較大吸光度值，考慮在280 nm處，其他的黃酮類也會(huì)有最大吸收，從而干擾花青素的測(cè)定.同時(shí)，由圖1可以得到紫茄皮花青素樣品在510 nm和280 nm下也同樣有吸收峰，說(shuō)明紫茄皮中含有花青素.因此，本研究以510 nm處測(cè)得的吸光度值為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行花青素的含量計(jì)算.

圖1 矢車菊－3－O－葡萄糖苷對(duì)照品光譜掃描曲線

圖2 矢車菊－3－O－葡萄糖苷對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

車菊－3－O－葡萄糖苷含量與其在510 nm波長(zhǎng)下的吸光度值之間有較好的線性關(guān)系，見(jiàn)圖2.在此濃度范圍內(nèi)，得到的線性回歸方程為Y=65.421X －0.004，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 1.

2.2 單因素對(duì)紫茄皮花青素提取率的影響

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫茄皮花青素提取率的影響

圖3為乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫茄皮花青素提取率的影響.隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加花青素的提取率先上升后下降，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)提取率達(dá)到最大.可能是因?yàn)殡S乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，溶劑的滲透能力也隨之增加，有利于花青素水溶性物質(zhì)的溶出，但乙醇體積分?jǐn)?shù)高于60%，極性過(guò)低反而不利于花青素物質(zhì)的溶出[25].2.2.2 液料比對(duì)紫茄皮花青素提取率的影響

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素提取率的影響

從圖4可見(jiàn)，固定其他因素不變，隨著液料比的增加花青素的提取率先上升后下降，在液料比為60∶1mL/g時(shí)提取率達(dá)到最大.說(shuō)明花青素得到充分溶解，溶液達(dá)到飽和狀態(tài)，溶液中花青素含量達(dá)到最大值，當(dāng)提取液繼續(xù)增大時(shí)，花青素提取率下降，造成溶劑的浪費(fèi)[26－27].所以選取 60∶1mL/g 為最佳液料比.

圖4 液料比對(duì)花青素提取率的影響

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)紫茄皮花青素提取率的影響

從圖5可見(jiàn)，固定其他因素不變，當(dāng)超聲時(shí)間在20～50 min時(shí)，紫茄皮花青素隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)花青素的提取率逐漸上升，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，花青素的提取率開(kāi)始下降.這是因?yàn)?，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)紫茄皮花青素不斷溶出，在50 min時(shí)接近飽和，而花青素的穩(wěn)定性較差，繼續(xù)延長(zhǎng)浸提時(shí)間，提取率反而稍有下降[28].

圖5 超聲時(shí)間對(duì)花青素提取率的影響

2.2.4 超聲功率對(duì)紫茄皮花青素提取量的影響

圖6為超聲功率對(duì)紫茄皮花青素提取量的影響:隨著超聲功率的增加花青素的提取率先上升后下降，在超聲功率為300 W時(shí)提取率達(dá)到最大.

圖6 超聲功率對(duì)花青素提取率的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面法設(shè)計(jì)方案及結(jié)果和回歸模型的方差分析見(jiàn)表2、3.應(yīng)用Design－Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次多元回歸模型為:

提取率/%=1.80 － 0.017A+0.055B － 0.011C －0.029D －0.053AB －0.009 125AC+0.009 575AD －0.039BC －0.012BD －0.030CD －0.050A2－0.016B2－0.069C2－0.025D2

由表3可知，模型的＜0.0001，表明模型的顯著性極高，Pred R2=0.932 5，Adj R2=0.972 2，說(shuō)明模型擬合良好.且由表3還可以看出，一次項(xiàng)A、B、C、D，二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2，交互項(xiàng) AB、BC、BD、CD顯著.

影響紫茄皮花青素提取率的四個(gè)因素的主次因素依次為:超聲功率(B)＞液料比(D)＞超聲時(shí)間(A)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)(C).利用RSM圖可以更直觀的看出最佳點(diǎn)及參數(shù)間的交互作用，如圖7～12，并得到提取紫茄皮花青素的最佳工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù) 58.81%、液料比 61.02∶1 mL/g、超聲時(shí)間42.32 min、超聲功率350 W，在此工藝條件下，花青素的提取率為1.89%.考慮到實(shí)際操作的方便，將提取工藝參數(shù)修正為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比60∶1 mL/g、超聲時(shí)間42 min、超聲功率350 W，在此條件下實(shí)際測(cè)得的提取率為1.82%，與理論預(yù)測(cè)值相比，由此證明試驗(yàn)?zāi)Ｊ胶侠?，結(jié)果理想.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

圖7 超聲功率、超聲時(shí)間對(duì)提取率影響

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間對(duì)提取率影響

圖9 液料比、超聲時(shí)間對(duì)提取率影響

圖10 乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率對(duì)提取率影響

圖11 液料比和功率對(duì)提取率影響

圖12 液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率影響

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助有機(jī)溶劑法提取紫茄皮中花青素，運(yùn)用pH示差法計(jì)算花青素的提取率，與傳統(tǒng)提取方法比較，超聲輔助有機(jī)溶劑法從紫茄皮中提取花青素的最佳提取時(shí)間短，提取率高，超聲功率為350 W、液料比為60∶1 mL/g(溶液體積/紫茄皮質(zhì)量)、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、時(shí)間為42 min，在此條件下紫茄皮花青素提取率為1.82%.因此無(wú)論從提取量角度，還是從節(jié)省時(shí)間角度考慮，超聲輔助有機(jī)溶劑法提取花青素都具有其獨(dú)特的優(yōu)越性[29－30].從紫茄皮中提取花青素可以充分利用茄子皮，降低環(huán)境污染，同時(shí)可生產(chǎn)高附加值的產(chǎn)品，為其他植物果蔬廢棄物的利用提供參考價(jià)值.

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