萊菔硫烷對阿爾茨海默病模型小鼠認知功能的干預作用

興述懷 朱春曉 張 瑞 趙 越 任亞浩 安 麗

(中國醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室，遼寧 沈陽 110001)

阿爾茨海默病(AD)不僅可以影響患者及其照顧者的生活質(zhì)量，而且增加了醫(yī)療成本，給全球帶來了重大的社會負擔。85歲以上的老年人群中AD的患病率更是高達20%以上〔1〕。目前我國AD患者已超過600萬，65歲以上人群當中患病率平均為6.6%，而且患病率每5年約增長1倍，80歲以上已超過22%。萊菔硫烷(SFN)是一種主要存在于十字花科類植物中的異硫氰酸酯類物質(zhì)，具有抗癌、抗凋亡、抗氧化以及清除自由基等生物功能〔2〕，研究發(fā)現(xiàn)SFN有很好的神經(jīng)保護作用〔3〕，然而關于SFN對AD的干預研究目前未見報道。AD早期表現(xiàn)主要以輕度認知記憶能力損傷為主，而海馬作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分是近期記憶回路的關鍵結構，是認知學習記憶的重要解剖基礎和神經(jīng)中樞〔4〕，海馬的CA1區(qū)與認知學習記憶能力密切相關且最易發(fā)生老化〔5〕。本研究采用鋁與D半乳糖聯(lián)合染毒建立AD小鼠模型〔6〕，通過觀察小鼠神經(jīng)行為學的改變，海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)和數(shù)目以及細胞超微結構的變化，探討SFN對AD模型小鼠的干預作用。

1 材料與方法

1.1 動物及實驗處理 健康成年C57BL/6小鼠(18～22 g)由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。將小鼠按體重隨機分為對照組、模型組和干預組，每組10只，雌雄各半。模型組與干預組小鼠連續(xù)13 w喂飼含鋁水(鋁濃度0.4 g/100 ml)，并隔日1次皮下注射200 mg/kg D-半乳糖;參照文獻〔7〕，干預組小鼠每日一次灌胃給予25 mg/kg SFN，模型組小鼠灌胃等量蒸餾水;對照組喂飼蒸餾水，并以相同的處理方式給予等量溶媒。

1.2 主要試劑與儀器 D-半乳糖與三氯化鋁(Sigma公司)、SFN(Toronto Research Chemicals，加拿大);Morris水迷宮、木質(zhì)曠場(自制)、攝影顯微鏡(Olympus，日本)、石蠟切片機(LEICA RM2155，德國)、透射電子顯微鏡(HITACHI H-7650，日本)

1.3 神經(jīng)行為學檢測

1.3.1 水迷宮實驗 參照文獻〔8〕采用Morris水迷宮檢測小鼠學習記憶能力的變化。Morris水迷宮是由一直徑為100 cm、高為50 cm的圓形水池組成。將水池分成4個象限，將直徑15 cm的圓形平臺固定放置于第2象限中央處，圓臺浸沒于水下1 cm，水溫為(22±2)℃。迷宮正上方裝有攝像頭，小鼠行程可被記錄下來。測試包括:①定位航行實驗:實驗每天相同時間進行，連續(xù)4 d，1次/d，分別從4個象限邊緣1/2弧度處將小鼠頭朝池壁入水，小鼠找到平臺的時間記為逃避潛伏期，自動攝像系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)記錄每只小鼠需找到平臺的逃避潛伏期，若小鼠入水后60 s內(nèi)未能找到平臺，則將其引置于平臺上并停留10 s，引導其學習記憶，此時逃避潛伏期記錄為60 s。②空間探索實驗:在定位航行實驗結束后的第2天撤去圓臺，于第四象限1/2弧度處入水點將小鼠面向池壁放入水中，電腦記錄60 s內(nèi)小鼠跨越圓臺所在位置的次數(shù)。

1.3.2 曠場實驗 參照文獻〔9〕應用自制木質(zhì)曠場觀察小鼠適應新環(huán)境的空間認知與自主探索能力。實驗裝置為一木制曠場(100 cm×100 cm×30 cm)，將箱底劃分成25個20 cm×20 cm方格，四壁為外周格，中央為中央格。實驗開始時，將小鼠放在中央格處，觀察錄像中3 min內(nèi)小鼠在中央格停留時間、跨格個數(shù)、直立次數(shù)。

1.4 細胞形態(tài)學檢測

1.4.1 尼氏染色 每組各取8只小鼠，乙醚麻醉處死后迅速取腦，制成5 μm石蠟切片依次放入二甲苯和梯度酒精脫蠟，水洗，37℃溫箱內(nèi)硫堇浸染30 min，水洗，95%酒精分化20 s，水洗，梯度酒精與二甲苯脫水，最后使用中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)及數(shù)量變化，隨機選取10個視野進行神經(jīng)細胞計數(shù)，結果以所觀察視野的平均細胞數(shù)表示。

1.4.2 電鏡標本制作 每組另外2只小鼠處死后迅速剝離海馬組織，并將1.5 mm3海馬CA1區(qū)移置于0.38 mol/L戊二醛PBS溶液中固定1 h，0.039 mol/L四氧化鋨中固定2 h，然后經(jīng)酒精及丙酮系列脫水，使用環(huán)氧樹脂包埋制成超薄切片，切片使用醋酸鈾及枸櫞酸鉛染色。透射電鏡下觀察海馬CA1區(qū)亞細胞結構變化。

2 結果

2.1 神經(jīng)行為學結果 隨著實驗天數(shù)的增加，各組小鼠的逃避潛伏期逐漸縮短，說明各組小鼠均有一定的記憶能力;實驗開始第1天模型組小鼠逃避潛伏期與對照組相比明顯延長(P＜0.05);干預組小鼠與模型組相比，逃避潛伏期有所縮短。從第2天起，模型組小鼠逃避潛伏期與對照組相比明顯延長(P＜0.05)干預組小鼠與模型組相比，逃避潛伏期縮短(P＜0.05)?？臻g探索實驗顯示:模型組穿越原圓臺所在位置的次數(shù)明顯少于對照組(P＜0.05);干預組小鼠與模型組相比，穿越原圓臺所在位置的次數(shù)增多(P＜0.05)。見表1。曠場實驗:模型組小鼠與對照組相比，穿越跨格數(shù)減少，中央格停留時間明顯延長(P＜0.05)，直立次數(shù)減少，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);而干預組小鼠與模型組相比，穿越跨格次數(shù)明顯增加(P＜0.05)，中央格停留時間有減少的趨勢，直立次數(shù)有所增加，但差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

表1 水迷宮定位航行與空間探索結果(n=10，±s)

表1 水迷宮定位航行與空間探索結果(n=10，±s)

與對照組相比較:1)P＜0.05，與模型組相比較:2)P＜0.05，下表同

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 穿越平臺(次)對照組24.40±11.43 19.22±4.41 14.82±6.59 7.45±3.23 2.90±1.85模型組35.02±10.831)29.67±6.591)23.40±8.311)15.72±7.491)1.00±0.941)干預組 28.70±8.19 21.52±6.862)16.42±7.452)8.62±3.262)3.10±2.232)

表2 曠場實驗結果(±s，n=10)

表2 曠場實驗結果(±s，n=10)

直立次數(shù)對照組組別 跨格數(shù) 中央格停留時間(s)42.40±18.95 2.70±1.63 6.80±4.46模型組 27.60±10.521) 8.60±9.131) 4.00±3.46干預組 44.90±13.172)3.60±4.37 5.10±4.45

2.2 電鏡觀察結果 對照組小鼠海馬CA1區(qū)細胞結構完整，細胞核膜光滑，線粒體結構正常，形態(tài)呈圓形或橢圓形，突觸結構清晰完整。模型組小鼠海馬CA1區(qū)細胞結構有所損傷，細胞核形態(tài)不規(guī)則，線粒體出現(xiàn)空泡狀異常，突觸結構受損，突觸間隙模糊。干預組小鼠海馬CA1區(qū)細胞結構較為完整，細胞核形態(tài)較為正常，線粒體結構恢復正常，突觸結構較為完整，突觸間隙基本正常。見圖1。

2.3 尼氏染色結果 如圖2所示，對照組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量較多，排列緊密，結構完整;模型組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量明顯減少，排列散亂不規(guī)則。干預組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量較為正常，細胞排列較為規(guī)則。見圖1。模型組小鼠(55.81±9.57)海馬CA1區(qū)平均每個視野的神經(jīng)細胞數(shù)明顯低于對照組小鼠(72.76±8.04)(P＜0.05)，與模型組小鼠(55.81±9.57)相比，干預組小鼠(68.73±8.74)海馬CA1區(qū)平均每個視野的神經(jīng)細胞數(shù)量明顯增多(P＜0.05)。

圖1 小鼠海馬CA1區(qū)電鏡結果(×20 000)

圖2 小鼠海馬CA1區(qū)尼氏染色結果(×200)

3 討論

AD主要引起病患認知功能的損傷，在臨床上通常表現(xiàn)為神經(jīng)行為學的變化。目前已有許多藥物可以改善AD病患的認知功能，但長期使用的毒副作用不容忽視。隨著姜黃素、白藜蘆醇、茶多酚等植物化學物對AD的防治作用逐漸被人們所證實，利用天然的膳食成分防治AD的研究日益受到關注。SFN廣泛存在于西蘭花等十字花科植物中，是一種天然的、有效性較強的、間接的抗氧化劑。研究發(fā)現(xiàn)〔3，10〕，SFN在慢性缺血性腦損傷和急性給予6-羥基多巴胺腦染毒動物模型中都已被證實具有良好的神經(jīng)保護作用。另有學者報道〔11〕，SFN對PD的神經(jīng)行為損傷亦有一定的改善作用，還有實驗證明應用SFN作用于皮質(zhì)損傷后的大鼠可以顯著提高其空間學習和記憶能力，并可緩解認知功能障礙〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn)SFN可明顯改善AD模型小鼠的認知功能，說明了SFN對認知功能障礙具有正向干預作用。

SFN對AD小鼠產(chǎn)生的干預作用可能與多種機制有關。研究證明〔13〕，經(jīng)SFN預處理的實驗動物海馬中Nrf2和血紅素氧合酶-1表達增強，從而可以減弱神經(jīng)細胞損傷及抑制炎癥反應的現(xiàn)象。SFN還能夠通過激活Nrf2-ARE通路，從而誘導一系列Ⅱ相酶和抗氧化酶進而增強機體抗氧化能力〔12〕，而這種抗氧化作用對神經(jīng)細胞損傷的修復具有重要意義。本實驗中干預組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞較模型組顯著增加;超微層面觀察小鼠海馬CA1區(qū)細胞發(fā)現(xiàn)干預組小鼠與模型組相比核膜與細胞器等結構損傷也都有所修復，可見SFN對小鼠海馬神經(jīng)細胞損傷具有一定的修復作用。SFN亦能上調(diào)醌氧化還原酶-1等的表達抑制氧糖剝奪誘導的未成熟海馬神經(jīng)元的死亡〔14〕，此機制可能與本實驗中干預組海馬神經(jīng)細胞數(shù)量恢復有關。SFN還具有防止細胞膜損傷，抑制DNA片段分解和阻抑活性氧形成等的生物功效〔15〕，線粒體的異常改變與活性氧具有一定聯(lián)系，SFN可能通過修復線粒體進而增強海馬內(nèi)的能量代謝，提升神經(jīng)細胞活力達到改善認知功能的目的。此外，本實驗采用的是鋁聯(lián)合D半乳糖染毒造模，而SFN可以拮抗一些有害金屬元素〔16〕，增強神經(jīng)細胞對有害元素毒性的抵抗力以促進神經(jīng)細胞的存活。

總之，SFN可明顯改善AD模型小鼠認知功能，保護海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞，但其具體機制仍需進一步探討。

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