姜黃素對放療致Lewis肺癌荷瘤小鼠機體損傷的保護作用

錢 程 施 丹 武 寧 程光惠(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春 30033)

盡管放射治療在腫瘤的治療過程中起到了至關(guān)重要的作用，但放射治療過程中不僅殺傷腫瘤細胞，對正常組織細胞也有殺傷作用，并伴隨著產(chǎn)生了神經(jīng)毒性、腎毒性、骨髓抑制、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)〔1〕。姜黃素是從姜黃屬植物姜黃、郁金、莪術(shù)等植物的根莖中提取出來的多元酚，具有多種藥理活性:抗動脈硬化、抗炎、抗氧化、抗凝、抗微生物等〔2～4〕，尤其具有明確的抗腫瘤作用〔5〕。有文獻報道，姜黃素對宮頸癌、肝癌、喉癌等具有放療增敏作用〔6～8〕，但對放療致機體損傷的保護作用鮮有報道。本實驗擬觀察姜黃素對放療致Lewis肺癌荷瘤小鼠機體損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物 C57BL/6純系小鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，體重18～22 g，雌雄各半，實驗前常規(guī)飼養(yǎng)7 d，動物合格證號:SCXK11-00-0006。

1.2 試劑與材料 姜黃素購自Sigma公司，－20℃保存，使用前用0.5%CMC-Na溶液稀釋至所需濃度;Lewis肺癌瘤株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供;Yac-1細胞、CTLL2依賴細胞由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室提供;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、刀豆蛋白(Con)A購自Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司;新生小牛血清(FCS)購自杭州四季青生物有限公司;DMSO購自北京北化精細化學(xué)品責(zé)任有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 荷瘤小鼠模型的建立 取傳代Lewis肺癌生長狀態(tài)良好的小鼠，在無菌條件下剝離瘤組織，研磨成腫瘤勻漿，PBS洗2遍，以RPMI1640完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液，用臺盼藍染色，計數(shù)，調(diào)整細胞的濃度(1×106±5%)個/0.2 ml。接種于C57BL/6小鼠左腹股溝皮下，0.2 ml/只。接種成功以移植瘤長至直徑5 mm為標(biāo)準(zhǔn)，按體重將荷瘤小鼠隨機分成對照組、放射組、姜黃素組和姜黃素+放射聯(lián)合組。

1.4 姜黃素對荷瘤小鼠放療后瘤重及抑瘤率的影響 待腫瘤體積為100 mm3時，對照組和放射組給予等體積0.5%CMC-Na灌胃，姜黃素組灌胃給予姜黃素15 mg/kg，放射組一次性給予20 Gy射線照射，聯(lián)合組給予姜黃素15 mg/kg和一次性20 Gy射線照射。照射完畢后繼續(xù)飼養(yǎng)，末次給藥后處死小鼠，稱取體重、腫瘤重量及體積，脾及胸腺重量，計算腫瘤生長抑瘤率(IR)。IR(%)=(模型組平均瘤重－給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。

1.5 姜黃素對荷瘤小鼠放療后外周血白細胞及骨髓有核細胞計數(shù)的影響 給藥后各組隨機取10只動物(雌雄各半)，腹主動脈采血50 μl注入稀釋液中，用全自動動物血球計數(shù)儀測定外周血常規(guī)計數(shù)。然后剝離左側(cè)股骨，以3%醋酸10 ml沖出骨髓細胞，按白細胞計數(shù)方法，計算1根骨內(nèi)的骨髓有核細胞數(shù)量。

1.6 姜黃素對荷瘤小鼠放療后T淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能的影響無菌取脾制成單細胞懸液，洗2遍，用含10%FCS的培養(yǎng)基調(diào)整脾細胞濃度為1×107個/ml。加入96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，每只鼠3復(fù)孔。對照孔每孔加100 μl RPMI1640培養(yǎng)液，ConA 刺激孔每孔加 100 μl ConA(終濃度為 5 μg/ml)，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，加入 MTT 溶液(5 mg/ml)每孔 10 μl，繼續(xù)孵育4 h。吸棄孔內(nèi)上清液，加入 DMSO 100 μl，振蕩10 min。于570 nm波長處測定吸光度(OD)值，計算刺激指數(shù)(SI)。SI=ConA刺激孔OD均值/對照孔OD均值。

1.7 姜黃素對荷瘤小鼠放療后NK細胞活性的影響 取濃度為1×107個/ml脾單細胞懸液，調(diào) AC-1細胞懸液(活性 ＞95%)濃度至5×106個/ml。取96孔培養(yǎng)板，每只鼠設(shè)效應(yīng)細胞:靶細胞(20∶1)孔，加100 μl脾細胞懸液，100 μl YAC-1 細胞懸液;效應(yīng)細胞對照孔:100 μl脾細胞懸液+100 μl RPMI1640培養(yǎng)液;靶細胞對照孔:100 μl YAC-1懸液+100 μl RPMI1640培養(yǎng)液，均設(shè)3復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，各孔加入 MTT溶液(5 mg/ml)10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入100 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。于570 nm波長處測定吸光度(OD)值。計算NK細胞毒百分率(%)=〔靶細胞對照孔OD值－(效應(yīng)細胞對照孔OD值－效應(yīng)細胞OD值)〕/靶細胞對照孔OD值×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS12.0用軟件，計量資料以±s表示，組間差異比較t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對放射治療小鼠Lewis肺癌的增敏作用 與對照組比較，放射組荷瘤小鼠體重、瘤重及腫瘤體積明顯降低(P＜0.01或P＜0.001);姜黃素亦可使荷瘤小鼠瘤重、腫瘤體積明顯降低(P＜0.01)，腫瘤抑制率為33.78%。聯(lián)合應(yīng)用姜黃素和放射治療可使荷瘤小鼠瘤重、腫瘤體積明顯降低(P＜0.001)，腫瘤抑制率為65.25%。與單獨放射治療比較，聯(lián)合應(yīng)用可對抗放療致荷瘤小鼠體重降低(P＜0.01)，且荷瘤小鼠瘤重、腫瘤體積明顯下降(P＜0.01)，腫瘤抑制率顯著升高(P＜0.001)。見表1。

2.2 姜黃素對放射治療小鼠Lewis肺癌的減毒作用 與對照組比較，放射組在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時臟器指數(shù)、外周血白細胞總數(shù)及骨髓有核細胞數(shù)均明顯下降(P＜0.01或P＜0.001)。見表1。

表1 各組小鼠體重、瘤重、腫瘤體積、臟器指數(shù)、外周血白細胞總數(shù)及骨髓有核細胞數(shù)比較(±s)

表1 各組小鼠體重、瘤重、腫瘤體積、臟器指數(shù)、外周血白細胞總數(shù)及骨髓有核細胞數(shù)比較(±s)

與對照組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.001;與放射組比較:3)P ＜0.01，4)P ＜0.001

組別 n 體重(g) 瘤重(g) 腫瘤體積(mm3) 胸腺指數(shù) 脾指數(shù) 白細胞(×109/L)骨髓有核細胞(×106/L)16±0.031 0.423±0.103 11.21±2.39 13.25±4.21放射組 13/11 19.18±2.891) 0.69±0.131)1 896.5±222.31)0.08±0.0232) 0.412±0.085 5.05±2.172) 4.04±1.232)姜黃素組 10/10 20.50±1.79 0.65±0.171)1 716.4±211.61)0.09±0.0212)0.392±0.0811)3)6.96±1.271)3)6.33±2.091)3)姜黃素+放射聯(lián)合組 10/10 20.98±2.633)0.37±0.122)3)1 024.9±188.92)3)0.18±0.0273)0.358±0.0661)3)8.87±2.351)4)8.25±1.341)4)對照組 12/12 21.78±2.53 1.09±0.21 2 140.6±289.64 0.

2.3 姜黃素對放射治療小鼠Lewis肺癌T淋巴細胞轉(zhuǎn)化和NK細胞活性的影響 與對照組比較，放射組ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞增殖反應(yīng)〔(0.15±0.04)vs(0.22±0.05)〕及小鼠NK細胞活性明顯降低〔(15.17±3.78)%vs(20.15±3.79)%，P＜0.05〕。姜黃素與放射治療合用，可使ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細胞增殖反應(yīng)顯著升高〔0.31±0.06，P＜0.05〕，亦可明顯提高小鼠NK細胞活性〔(22.16±2.79)%，P＜0.05〕。姜黃素組SI為0.23±0.06，NK細胞活性為(20.02±3.17)%。

3 討論

應(yīng)用有效的輔助藥物減輕放療所致的機體損傷已成為腫瘤治療中不可或缺的一部分。在腫瘤末期，患者的免疫缺陷顯得尤為明顯〔9〕。因此，對腫瘤患者來說，提高自身的免疫力是極為重要的。生理狀態(tài)下，肺臟含有相對數(shù)量多的NK細胞，是重要的、潛在的抗腫瘤效應(yīng)器〔10〕，在治療肺癌的過程中，研究NK細胞和T淋巴細胞的轉(zhuǎn)化功能具有重要的意義。實驗結(jié)果表明姜黃素與放療聯(lián)合應(yīng)用能明顯提高荷瘤小鼠的腫瘤抑制率，縮小腫瘤的體積，與放療協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用;姜黃素與放療聯(lián)合應(yīng)用可減輕單獨放療所致的骨髓抑制、外周血白細胞水平降低、免疫器官萎縮，對放療有減毒增效的作用;姜黃素與放療聯(lián)合應(yīng)用比單獨應(yīng)用放療對NK細胞活性及T淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能作用明顯，可使NK細胞活性及T淋巴細胞轉(zhuǎn)化功能均顯著提高，提示姜黃素能增強荷瘤小鼠的免疫力。綜上所述，姜黃素對放療致荷瘤小鼠機體損傷具有保護作用，其機制可能與抗貧血、升高白細胞及免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

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