熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤染色體

辜學(xué)忠 史克倩 聞 艷 楊同華 沈曉梅 陸智祥 賴 洵

(云南省第一人民醫(yī)院血液科，云南 昆明 650032)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)患者多存在染色體異常的改變，其病變過(guò)程與MM的發(fā)病機(jī)制、臨床分期、免疫學(xué)分型與臨床預(yù)后存在緊密聯(lián)系〔1〕。本研究主要研究熒光原位雜交(FISH)在MM染色體異常檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，以期改善血液系統(tǒng)疾病的診斷與治療效果。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象 選取2012年1月至2014年1月本院收治的初治MM患者24例，均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》〔2〕，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫固定電泳、血清免疫球蛋白等檢查確診。其中男女比例15∶9，年齡37～76歲，中位年齡64歲，骨髓漿細(xì)胞比例15.5%～86.5%，免疫學(xué)分型:IgA型6例(其中κ型3例，λ型3例)，IgG型15例(其中 κ型6例，λ型9例)，IgM 型1例，輕鏈型2例;Durie-Salmon分期標(biāo)準(zhǔn)分期:IA期2例，IB期1例，ⅡB期3例，ⅢA期15例，ⅢB期3例。

1.2 儀器與試劑 MM檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司，共包含五組DNA探針，分別為:GLP RB1、GLP P53、GLP D13S319、GLP IGH、GLP 1q21;甲酰胺、洗滌液、緩沖液、無(wú)水乙醇、淋巴細(xì)胞分離液等均購(gòu)自昆明中云美生物技術(shù)有限公司;采用Carl Zeiss Axio Scope A1熒光顯微鏡，IKaros、Isis圖像分析系統(tǒng)行骨髓標(biāo)本分析。

1.3 常規(guī)G顯帶技術(shù) 采集患者的2 ml骨髓，常規(guī)G顯帶技術(shù)檢測(cè)染色體，參照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制》進(jìn)行染色體核型識(shí)別與描述〔3〕。

1.4 FISH技術(shù) 肝素管采集患者的2 ml骨髓，提取有核細(xì)胞、制片，按照探針試劑說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行DNA變性、雜交、洗片、復(fù)染。在熒光顯微鏡下分析患者的骨髓標(biāo)本，選用合適的濾片組，在100倍物鏡下觀察細(xì)胞核的FISH結(jié)果并進(jìn)行信號(hào)計(jì)數(shù)和比值計(jì)算，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)異常細(xì)胞所占的百分率。

1.5 判斷標(biāo)準(zhǔn) RB1與P53基因異常:細(xì)胞內(nèi)只有1個(gè)綠色熒光信號(hào)，D13S319基因缺失:細(xì)胞內(nèi)只有1個(gè)紅色熒光信號(hào)，IGH基因異常:細(xì)胞內(nèi)有分離的紅色或綠色熒光信號(hào)，1q21基因異常:細(xì)胞內(nèi)有3個(gè)紅色熒光信號(hào)〔4〕;MM陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn):患者異常百分比大于正常閾值〔5〕。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析，組間比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩種不同檢測(cè)方案的染色體異常檢出情況 常規(guī)G顯帶技術(shù)的1q21陽(yáng)性率與染色體異?？倷z出率均顯著低于FISH(P＜0.01);常規(guī)G顯帶技術(shù)未檢出其余四種異常，F(xiàn)ISH的檢出率明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表1。2.2 FISH的染色體異常檢出情況 14例檢出基因異常的MM患者中，4例(16.67%)為一種異常者，5例(20.83%)為兩種異常者，4例(16.67%)為三種異常者，1例(4.17%)為四種異常者。

表1 兩種不同檢測(cè)方案的染色體異常檢出情況〔n(%)，n=24〕

2.3 染色體異常與免疫學(xué)分型與臨床分期相關(guān)性 MM患者存在染色體異常的主要免疫學(xué)分型為IgG型，臨床分期為ⅢA期。不同免疫學(xué)分型與臨床分期的染色體異常檢出率組內(nèi)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 染色體異常與免疫學(xué)分型與臨床分期相關(guān)性〔n(%)〕

3 討論

細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的研究成果指出，MM患者的染色體改變與其分型、分期及預(yù)后有關(guān)，可見(jiàn)染色體異常改變?cè)贛M的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用，深入分析染色體異常情況利于指導(dǎo)臨床診斷及治療〔6，7〕。傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)方法主要通過(guò)有絲分裂與中期分裂分析染色體異常情況，但MM患者的細(xì)胞分裂指數(shù)較低，處于增殖期的腫瘤細(xì)胞通常不到1%，因此，傳統(tǒng)染色體檢測(cè)方法的檢出率僅為25%～30%〔8〕。FISH技術(shù)采用設(shè)定特異性探針，使用未培養(yǎng)的間期細(xì)胞來(lái)識(shí)別與描述染色體核型，有效改善了檢測(cè)的特異性與靈敏度，提高異常染色體的檢測(cè)效果。

本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道〔9〕結(jié)果一致，證實(shí)MM患者染色體異常以IGH基因重排最常見(jiàn)。分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)表明，13號(hào)染色體的缺失對(duì)M患者的生物學(xué)行為有一定影響，臨床檢測(cè)常用探針為RB1、D13S319，其檢測(cè)結(jié)果已作為負(fù)性預(yù)后指數(shù)用于評(píng)價(jià)臨床治療方案的療效〔10〕。本研究表明P53基因缺失多發(fā)生在MM晚期且發(fā)生率較低，分析原因是:P53基因缺失是MM患者疾病進(jìn)展中的一個(gè)繼發(fā)事件，作為短生存期的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，其出現(xiàn)可提高機(jī)體抗化療藥物的敏感性，激活血管新生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，增加骨髓中的微循環(huán)血量，縮短患者生存期，此生物學(xué)異常在臨床中較少見(jiàn)〔11，12〕。進(jìn)一步分析染色體異常與免疫學(xué)分型的相關(guān)性，得出MM患者的免疫學(xué)分型以IgG型為主，其具體影響機(jī)制有待臨床擴(kuò)大樣本容量，繼續(xù)深入研究與驗(yàn)證。

綜上所述，MM患者應(yīng)用FISH技術(shù)行染色體異常檢測(cè)，可相應(yīng)提高其臨床確診率，發(fā)現(xiàn)常規(guī)G顯帶技術(shù)不能檢出的基因位點(diǎn)缺失與重排，其中染色體異常以13號(hào)染色體缺失與IGH基因重排較為常見(jiàn)，染色體異常與臨床分期與免疫學(xué)分型之間有相關(guān)性，以Ⅲ期和IgG型為主，根據(jù)檢查結(jié)果，有助于判斷患者疾病分型及分期，給予針對(duì)性的治療措施，從而延長(zhǎng)患者生存期，保障其生活質(zhì)量及生命安全，利于指導(dǎo)臨床診斷與治療。

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