星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中HSP70的表達(dá)及生物學(xué)活性

王曉東 陳善成 楊俊葆 李 衛(wèi) (暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 廣州 510632)

手術(shù)治療膠質(zhì)細(xì)胞瘤僅局限于減少腫瘤體積、降低腫瘤細(xì)胞數(shù)量，而手術(shù)后的化療、放療等綜合治療并未能顯著改善患者預(yù)后，部分惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者術(shù)后的生存期不足1年〔1〕。探討與人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性程度相關(guān)的蛋白分子，明確其表達(dá)水平和生物學(xué)特性將為其診斷、預(yù)后和靶向治療提供依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白(HSP70)在腫瘤免疫中具有重要作用〔2〕。本文分析HSP70與腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤病理分級(jí)的相關(guān)性，并探討其表達(dá)水平對(duì)患者預(yù)后的評(píng)估價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 調(diào)查對(duì)象 收集某院2005年3月至2012年6月經(jīng)病理切片明確診斷為腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者62例的臨床資料。按WHO(2000、2007年)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)確定病理診斷和分級(jí)〔3〕:Ⅰ級(jí)10例、Ⅱ級(jí)21例、Ⅲ級(jí)19例、Ⅳ級(jí)12例，其中男37例，女25例，平均年齡(37.26±14.51)歲。另選取同期住院的需手術(shù)切除正常腦組織的腦創(chuàng)傷患者5例(正常腦組織組)。

1.2 蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學(xué)染色 腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織行HE切片，光鏡下隨機(jī)選擇腫瘤細(xì)胞豐富、分布均勻區(qū)域計(jì)數(shù)存在于胞質(zhì)內(nèi)的陽(yáng)性染色細(xì)胞個(gè)數(shù)進(jìn)行組織學(xué)分析HSP70的表達(dá)、出血及片狀壞死區(qū)不作為觀察區(qū)域。

1.2.1 HE染色 二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染色1～5 min，0.5%～1%鹽酸乙醇分化，1%氨水返藍(lán)，伊紅染色1～5 min，梯度乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟，梯度乙醇至水，3%H2O2去離子水孵育滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波修復(fù)抗原10 min，山羊血清(1∶20)封閉非特異性抗原室溫下60 min，傾去多余血清，加1∶100稀釋的鼠抗人HSP70一抗于切片上，置濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min×3次，滴加生物素化二抗工作液，加蓋濕盒內(nèi)室溫下60 min，PBS沖洗5 min×3次，加入鏈霉素合素-生物素復(fù)合物(SABC)免疫組化試劑，室溫60 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯色，顯微鏡下觀察，適時(shí)終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染15～30 s和封片。陽(yáng)性對(duì)照采用已知的膠質(zhì)細(xì)胞瘤的陽(yáng)性切片，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。染色陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞膜。

1.3 觀察方法 由兩位長(zhǎng)期從事免疫組化實(shí)驗(yàn)的醫(yī)生通過(guò)雙盲法觀察切片，先在低倍鏡下觀察大體著色情況，400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)高倍視野數(shù)取100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，各組數(shù)值以±s表示。HE染色切片腦組織病理形態(tài)學(xué)改變，進(jìn)行病理分級(jí)。染色強(qiáng)度根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比進(jìn)行定性分級(jí):病灶的表達(dá)＜20%為陰性(－)，＞20%為陽(yáng)性(+)，以定性分級(jí)結(jié)果比較HSP70表達(dá)與星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行分析，采用非參數(shù)Kraskal-Wallis、Dunnet-t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)和應(yīng)用生存分析。

2 結(jié)果

2.1 HSP70蛋白的分布與表達(dá) HSP70陽(yáng)性物質(zhì)呈棕色顆粒狀，位于膠質(zhì)細(xì)胞瘤的胞核和胞質(zhì)中，以灶狀或顆粒點(diǎn)狀分布，不同病理分級(jí)HSP70免疫組化圖片，見(jiàn)圖1。HSP70在正常腦組織中呈基礎(chǔ)分布，HSP70計(jì)數(shù)值平均為5.60±1.82，各級(jí)星形膠質(zhì)腫瘤細(xì)胞中HSP70分布呈逐級(jí)上升趨勢(shì)，經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，腫瘤分級(jí)與HSP70分布呈正相關(guān)(r=0.685，P＜0.001)，具體分布情況，見(jiàn)表1。以正常腦組織為參照，腫瘤Ⅲ、Ⅳ級(jí)腦細(xì)胞中HSP70計(jì)數(shù)值分別為38.11±16.75、55.17±24.96，明顯高于正常腦組織(P＜0.01)。腫瘤Ⅰ、Ⅱ級(jí)HSP70計(jì)數(shù)值分別為15.2±7.58、24.38±14.40。

2.2 HSP70表達(dá)與星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系 62例星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者中，21例HSP70表達(dá)增高，與正常腦組織有差異(P＜0.05);HSP70表達(dá)情況與性別、年齡無(wú)關(guān)(P＞0.05);膠質(zhì)瘤 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期中表達(dá)陽(yáng)性率。見(jiàn)表1。

2.3 生存率比較 隨訪觀察患者5年生存率，HSP70陽(yáng)性組5年生存率(36.1%)明顯低于HSP70陰性組(61.5%)(P=0.029)。生存曲線圖，見(jiàn)圖2。

圖1 不同病理分級(jí)HSP70免疫組化(DAB，×200)

表1 HSP70表達(dá)與星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系〔n(%)〕

圖2 HSP70陽(yáng)性與陰性組生存曲線

3 討論

HSPs是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)性蛋白質(zhì)，其作為一種“分子伴侶”參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、基因轉(zhuǎn)錄，幫助胞內(nèi)蛋白折疊、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)，并具備免疫保護(hù)作用〔4〕。在HSPs的大家族中，HSP70為高度保守的ATP酶，在細(xì)胞應(yīng)急或非應(yīng)急狀態(tài)下蛋白質(zhì)的代謝及調(diào)控中起重要作用，其表達(dá)水平的改變可以反映細(xì)胞老化狀態(tài)，還可以作為判斷細(xì)胞應(yīng)激能力和生理狀態(tài)的指標(biāo)。除了分子伴侶功能外，HSP70在腫瘤免疫中的重要作用近年來(lái)也備受關(guān)注。HSP70表達(dá)增強(qiáng)往往與腫瘤細(xì)胞的低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥等密切相關(guān)，可能參與腫瘤細(xì)胞的某些生物活動(dòng);另一方面又能誘導(dǎo)和增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤生長(zhǎng)。研究報(bào)道，HSP70參與了腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控和表型改變，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性使HSP70在與其相結(jié)合時(shí)成為腫瘤抗原多肽的靶載體，協(xié)助機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗原肽識(shí)別，從而誘導(dǎo)特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)〔5～7〕;HSP70能夠與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的腫瘤特異性抗原多肽結(jié)合形成復(fù)合物，通過(guò)與巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞的表面受體特異的結(jié)合而激活特異性抗腫瘤免疫，而主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子如CD91、CD40、趨化因子、TLR4等參與介導(dǎo)途徑〔8〕。HSP70可通過(guò)調(diào)整 Th1/Th2調(diào)整機(jī)體免疫狀態(tài)或直接活化TCRγδT細(xì)胞或自然殺傷(NK)細(xì)胞參與非特異的抗腫瘤免疫作用〔9〕。

正常組織細(xì)胞中的HSP70僅有少量表達(dá)，并主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，但在腫瘤細(xì)胞中，HSP70可擴(kuò)散出胞質(zhì)外的胞核和胞膜中。HSP70在腫瘤細(xì)胞中的異常定位與腫瘤自身的增生和無(wú)限生長(zhǎng)的腫瘤學(xué)特性相適應(yīng)，反映了腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。目前已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)HSP70的高表達(dá)〔5～7〕，在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的系列蛋白表達(dá)譜分析鑒定中，HSP70被認(rèn)為是高度惡性相關(guān)蛋白〔10〕。本研究結(jié)果說(shuō)明HSP70與膠質(zhì)瘤的分化程度有密切關(guān)系。文獻(xiàn)表明，HSP70作為“分子伴侶”可以調(diào)節(jié)和穩(wěn)定腫瘤的異常增殖過(guò)程，介導(dǎo)錯(cuò)配蛋白的降解，協(xié)調(diào)腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)快速代謝平衡從而使腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖，同時(shí)HSP70與腫瘤組織產(chǎn)生的多肽結(jié)合，通過(guò)MHC-I將抗原提呈給T淋巴細(xì)胞，引發(fā)抗腫瘤免疫〔11〕;HSP70通過(guò)阻礙細(xì)胞色素C/dATP介導(dǎo)半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspases)的激活，阻斷功能性凋亡蛋白體的裝配抑制凋亡的發(fā)生來(lái)抑制凋亡〔12〕;

惡性腫瘤中HSP70高表達(dá)還與病人的帶瘤生存期呈現(xiàn)一定相關(guān)性〔13〕。HSP70可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的一評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)也提示拮抗人腦膠質(zhì)瘤中HSP70的合成，阻斷HSP70的抗凋亡作用可為膠質(zhì)瘤的治療和改善膠質(zhì)瘤的預(yù)后提供一種新的思路和方法。目前，多種涉及HSP70介導(dǎo)途徑的治療方法在其他類腫瘤中都有研究，如利用HSP70具備的免疫佐劑的特性通過(guò)腫瘤組織提取或基因工程生產(chǎn)HSP70抗原肽復(fù)合物，作為疫苗免疫機(jī)體，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異的抗腫瘤免疫的CTL效應(yīng)〔14〕;利用HSP70分子伴侶作用，通過(guò)抗體阻斷〔15〕或反義脫氧寡核苷酸技術(shù)〔16〕抑制腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的HSP70，下調(diào)與腫瘤細(xì)胞惡性增生相關(guān)的基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性，達(dá)到提高腫瘤細(xì)胞放療、化療敏感性，進(jìn)而遏制腫瘤細(xì)胞的增生，誘導(dǎo)其死亡?？梢灶A(yù)見(jiàn)，隨著HSP分子生物學(xué)和免疫學(xué)機(jī)制的研究進(jìn)一步了解，伴隨對(duì)人腦膠質(zhì)瘤與HSP相關(guān)性的臨床研究進(jìn)一步深入，提高人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的生存期可期。

1 Sathomsumetee S，Rich JN，Reardon DA.Diagnosis and treatment of high-grade astrocytoma〔J〕.Neurol Clin，2007;25(4):1111-39.

2 Xiang TX，Li Y，Jiang Z，et al.RNA interference mediated silencing of the hsp70 gene inhibits human gastric cancer cell growth and induces apoptosis in vitro and in vivo〔J〕.Tumori，2008;94(4):539-50.

3 Fuller GN，Scheithauer BW.The 2007 revised World Health Organization(WHO)classification of tumours of the central nervous system:newly codified entities〔J〕.Brain Pathol，2007;17(3):304-7.

4 Hecker JG，MeGarvey M.Heat shock proteins as biomarkers for the rapid detection of brain and spinal cord ischemia:a review and comparison to other methods of detection in thoracic aneurysm repair〔J〕.Cell Stress Chaperones，2011;16(2):119-31.

5 Chen Y，Zhao M，Wang S，et al.A novel I role for DYX1C1，a chaperone protein for both Hsp 70 and Hsp 90，in breast cancer〔J〕.J Cancer Res CIin Oncol，2009;135(9):1265-76.

6 劉 凡，陳蘭英，黃 建，等.熱休克蛋白70在人食管癌EC9706細(xì)胞凋亡過(guò)程中的表達(dá)與定位變化〔J〕.解剖學(xué)報(bào)，2012;43(4):490-9.

7 王映梅，刁建升，閆慶國(guó)，等.膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡與熱休克蛋白70的表達(dá)〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010;18(10):1995-7.

8 Chen T，Cao X.Stress for maintaining memory:HSP70 as a mobile messenger for innate and adaptive immunity〔J〕.Eur J Immunol，2010;40(6):1541-4.

9 Gastpar R，Gross C，Rossbacher L，et al.The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells〔J〕.J Immunol，2004;172(2):972-80.

10 周金橋，王景濤，劉秋紅，等.人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性程度相關(guān)蛋白表達(dá)譜的分析與鑒定〔J〕.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2012;11(8):780-3.

11 葛 巖，王醫(yī)術(shù)，張海英，等.人腦膠質(zhì)瘤中HSP-60，70的表達(dá)〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009;13(9):1177-9.

12 Mclaughlinl B，Hartnett KA，Erhardt JA，et al.Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning〔J〕.Proc Natl Acad Sci，2003;100(2):715-20.

13 孟祥瑞，陸 鵬.食管鱗癌熱休克蛋白70表達(dá)與放療療效關(guān)系的研究〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2012;92(47):3367-70.

14 Gehrmann M，Radons J，Molls M，et al.The therapeutic implications of clinically applied modifiers of heat shock protein 70(Hsp70)expression by tumor cells〔J〕.Cell Stress Chaperones，2008;13(1):1-10.

15 張曉娟，董 堅(jiān)，吳振林，等.HSP70多肽復(fù)合物修飾DCs疫苗抗胰腺癌荷瘤小鼠的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2009;25(9):792-6.

16 趙東利，謝小衛(wèi)，王書(shū)文.熱休克蛋白70反義寡核苷酸誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞瘤凋亡的研究〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2007;15(7):909-11.