miR-126在人結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

宋軍民 楊 超 常 遠(yuǎn) 夏坤錕 王朝杰 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肛腸外科，河南 鄭州 450050)

結(jié)腸癌是常見的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤〔1〕，但是關(guān)于結(jié)腸癌遷移與侵襲的機(jī)制目前認(rèn)識(shí)尚有限。近來，越來越多的研究支持miRNAs與腫瘤相關(guān)〔2，3〕。有研究發(fā)現(xiàn) micro(miR)-126在不同結(jié)腸癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染前后表達(dá)水平不同，提示miR-126有可能與結(jié)腸癌有一定關(guān)系。本文通過穩(wěn)定表達(dá)miR-126的結(jié)腸癌細(xì)胞系了解miR-126的表達(dá)及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2014年1月在我院腫瘤科確診為結(jié)腸癌并且行手術(shù)治療的患者80例，每例患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療。男46例，女34例，年齡38～55〔平均(47.0±2.5)〕歲;高分化14例，中分化51例，低分化15例;Dukes分期:A期12例，B期22例，C期31例，D期15例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例。所有組織于離體15 min內(nèi)置于液氮罐中保存。

1.2 細(xì)胞系、載體及試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、人胚腎細(xì)胞株(HEK293T)。慢病毒表達(dá)載體pGIPZ、慢病毒包裝質(zhì)粒pCD/NL-BHDDD、慢病毒膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒 pLTRG。Lipofectamine2000，快速限制性內(nèi)切酶 CLai、MLui、T4DNA 連接酶，八肽膽囊收縮術(shù)(CCK-8)試劑盒、DMEM培養(yǎng)液、hsa-miR-126原位雜交探針。胎牛血清，總RNA提取液，胰島素受體底物(IRS)-1兔單克隆抗體。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株在含有10%進(jìn)口胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中37℃、5%CO2飽和濕度貼壁傳代培養(yǎng)，在細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)(取對(duì)數(shù)生長期)用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 RT-PCR檢測 利用總RNA提取液，嚴(yán)格按照提取液操作說明書提取結(jié)腸癌組織和癌旁組織中總RNA，cDNA的制備按照 All-in-one miRNA qRT-PCR Detectionkits，反應(yīng)體系:RNA 2 μg，poly A polymerase(2.5 U/μl，1 μl)，RTase Mix 1 μl，5×反應(yīng)緩沖液 5 μl，加 H2O至終體積 25 ml。反應(yīng)條件:37.5℃ 90 min，80℃ 5 min，25℃保存。實(shí)施定量PCR的反應(yīng)體系同樣按照All-in-one miRNA qRT-PCR Detectionkits說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件:預(yù)期變性90℃ 10 min，90℃ 10 s，退火60℃ 30s。

1.3.3 miR-126慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建 利用Primes軟件設(shè)計(jì)引物，同時(shí)引入CLai、MLui酶切位點(diǎn)及引物的序列及末端的保護(hù)堿基。引物序列正義:5'-CGACGCGTCGGGTTTACAGAACACCCATCA-3'，反義:5'-CCATGGGGCCACAGCAACAAAAGACT-3'，擴(kuò)增的片段長度為357 bp。以正常黏膜組織基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增miR-126。PCR成功擴(kuò)增出包含miR-126前體及側(cè)翼序列的DNA片段，將擴(kuò)增后片段利用2%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳直至沒有出現(xiàn)雜質(zhì)帶，然后對(duì)PCR產(chǎn)物純化回收。由CLai、MLui酶切的PCR產(chǎn)物與pGIPZ載體連接，然后再經(jīng)過轉(zhuǎn)化，于無菌操作臺(tái)中挑選單個(gè)克隆放入培養(yǎng)基中并搖菌過夜，對(duì)目的片段經(jīng)PCR鑒定正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取制備小量質(zhì)粒，鑒定出的陽性質(zhì)粒經(jīng)過DNA測序后得到pGIPZ-miR-126重組質(zhì)粒。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 嚴(yán)格按照Lipofectamine2000試劑說明書操作，采用陽離子脂質(zhì)體法進(jìn)行病毒包裝。轉(zhuǎn)染前24 h，將處于對(duì)數(shù)生長期的HEK293T接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞。使用含10%進(jìn)口胎牛血清的高糖型DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度到70%～90%后進(jìn)行病毒包裝，分為 pGIPZ-miR-126轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組(pGIPZ)。將兩組病毒上清分別感染SW480細(xì)胞，感染72 h后，熒光顯微鏡下觀察到感染成功的細(xì)胞中綠色熒光蛋白(GFP)發(fā)綠色熒光，成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞后利用流式細(xì)胞儀分選GFP陽性的SW480細(xì)胞。分選的細(xì)胞純度達(dá)95%以上，然后置于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.5 CCK-8檢測結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力 在96孔板中按每孔2×103細(xì)胞配制100 ml的細(xì)胞懸液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在37℃ 5%CO2的條件下將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h;向培養(yǎng)板各加入10 ml轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞;將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，向每孔加入10 ml CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h;取細(xì)胞轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、48 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行CCK-8檢測，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長處測定其吸光度，重復(fù)3次。

1.3.6 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力 將兩組細(xì)胞分別接種于6孔板，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。待長至臨近飽和時(shí)，用10 μl微量移液頭消毒后在細(xì)胞板上垂直劃痕，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。倒置顯微鏡下每隔24 h觀察各組細(xì)胞的遷移情況并拍照。

1.3.7 Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲能力 小室接種細(xì)胞前2 h將基質(zhì)膠Matrigel用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為1∶5，每個(gè)小室加50 μl，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h;接種200 μl無血清培養(yǎng)基細(xì)胞(5×105/ml)，下室加入600 μl含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)24～48 h后，取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定下室面，結(jié)晶紫染色，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗滌。顯微鏡下隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS16.0軟件進(jìn)行χ2及t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR檢測miR-126在結(jié)腸癌組織中表達(dá) 結(jié)腸癌組織中miR-126表達(dá)陽性率顯著低于癌旁正常黏膜組織(P＜0.05)。見表1。并且，miR-126的表達(dá)與年齡、性別及分化程度無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，與結(jié)腸癌臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P＜0.05)。見表2。

表1 miR-126在結(jié)腸癌和癌旁正常黏膜中的表達(dá)〔n(%)〕

表2 miR-126表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床特征的相關(guān)性分析(n)

2.2 miR-126表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

2.2.1 miR-126表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞生長的影響 隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力明顯低于空白對(duì)照組。見表3。

表3 miR-126對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響〔±s，n=3，L/(g·cm)〕

表3 miR-126對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響〔±s，n=3，L/(g·cm)〕

12 h 24 h 48 h對(duì)照組組別0.325±0.010 0.449±0.012 0.738±0.017轉(zhuǎn)染組 0.265±0.008 0.335±0.007 0.366±0.012 t/P值8.115/0.001 14.213/0.000 23.517/0.000

2.2.2 miR-126表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞遷移能力的影響 對(duì)SW480兩組細(xì)胞劃痕處理后，間隔24 h連續(xù)觀察細(xì)胞的遷移情況，可見空白對(duì)照組劃痕72 h后，細(xì)胞已基本完全覆蓋劃痕區(qū)域，而轉(zhuǎn)染組則未完全覆蓋。表明miR-126具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的能力。

2.2.3 miR-126表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞侵襲能力的影響 鋪有基質(zhì)膠的細(xì)胞培養(yǎng)36 h后，轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組細(xì)胞遷移至下室的細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為(10±4.81)個(gè)和(262±31.26)個(gè);無基質(zhì)膠的細(xì)胞在培養(yǎng)36 h后計(jì)數(shù)遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目，轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組分別為(81±14.27)個(gè)和(341±24.23)個(gè)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

結(jié)腸癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康，發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移為其主要死因。MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA，它們在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，導(dǎo)致靶基因在 mRNA水平降解或引起蛋白翻譯抑制〔4～6〕。miRNAs在細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、基因調(diào)控及腫瘤的轉(zhuǎn)移等多種生物過程中起著十分重要的作用〔7，8〕。在分析這些miRNA分子的生物學(xué)功能時(shí)，發(fā)現(xiàn)miR-126與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并有研究報(bào)道其在結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)〔9〕。前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-126具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的能力，可見在結(jié)腸癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的過程中miR-126發(fā)揮舉足輕重的作用〔10，11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明miR-126可以明顯抑制細(xì)胞增殖，發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。同時(shí)，miR-126可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力及侵襲能力，發(fā)揮抑制結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的功能。綜上所述，在結(jié)腸癌中存在miR-126表達(dá)下調(diào)，其下調(diào)與結(jié)腸癌是否發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)miR-126可通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲而發(fā)揮抑瘤作用，為結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移抑制性miRNA。

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