光照對苦蕎芽多酚類物質(zhì)及抗氧化活性的影響

殷培蕾，李 靜，鄧園園，閆 娟，彭鐮心，趙 鋼

(1.西華大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 成都 610039;2.成都大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 成都 610106)

0 引 言

蕎麥屬蓼科蕎麥屬雙子葉作物［1－2］，苦蕎與甜蕎是兩種主要的栽培種，其中，苦蕎不僅含有黃酮、D-手性肌醇(DCI)、γ-氨基丁酸(GABA)，大黃素［3－5］等有效成分，還含有豐富且更為平衡的氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等［6－9］.萌發(fā)以后的苦蕎，其脂肪酸和氨基酸的營養(yǎng)價值更高，更能滿足人體的需要.另外，萌發(fā)一段時間的苦蕎芽，其黃酮和酚酸類物質(zhì)的含量會大幅增加［10－11］.所以，生產(chǎn)苦蕎芽可增加其附加值，改變苦蕎以苦蕎茶產(chǎn)品為主的現(xiàn)狀，為苦蕎的深加工奠定一定的基礎(chǔ)［12］.相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎中黃酮等多酚類成分與苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonia-1yase，PAL)活力的高低有非常密切的關(guān)系，而PAL 活性受光照、溫度、誘導(dǎo)劑等因素影響［13－17］.在此基礎(chǔ)上，為更全面地評價光照對苦蕎芽品質(zhì)的影響，本研究對光照與黑暗條件下苦蕎芽中綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、葒草素、異葒草素、阿魏酸、牡荊素、蘆丁、槲皮素、山奈酚10 種酚類物質(zhì)進行測定，并采用主成分分析和聚類分析研究光照對苦蕎芽中多酚類物質(zhì)的影響規(guī)律，同時分析光照對苦蕎芽抗氧化活性的影響情況.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 種 子.

實驗所用蕎麥品種為西蕎一號，其種子于2012年11月采收于成都大學(xué)蕎麥試驗田.

1.1.2 儀器與試劑.

實驗所用儀器包括:高效液相色譜儀(日本島津儀器公司)，LGJ-10C 型四環(huán)凍干機，PQX-300B 型多段可編程人工氣候箱，DHP-9160B 型智能電熱恒溫培養(yǎng)箱，TDL-4A 型離心機，DFT-100 型手提式高速粉碎機，Spectrum 量子光亮計，ESJ210-4B 型電子天平，KH5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器，SHZ-95B 型循環(huán)水式多用真空泵.

實驗所用試劑包括:綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、葒草素、異葒草素、阿魏酸、牡荊素、蘆丁、槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)，甲醇(HPLC級，Sigma-Aldrich 公 司)，冰 乙 酸(AR 級)、磷 酸(HPLC 級，科密歐公司)，實驗用水為樂百氏純凈水.

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蕎的發(fā)芽條件.

分別稱取20 g 西蕎一號種子12 份，于1%的鹽水中浸泡15 min，之后用蒸餾水洗凈，轉(zhuǎn)移至墊有濾紙的發(fā)芽盤中，隨機分配光照組和黑暗組各6 盤，放入恒溫培養(yǎng)箱先黑暗培養(yǎng)3 天，再分別進行光照處理(光照條件:16 h 光照，8 h 黑暗進行循環(huán);光密度，74.65 μmol/m2/s;溫度，25 ℃;濕度，75%)和黑暗處理(黑暗條件:始終處于黑暗狀態(tài);溫度，25 ℃;濕度，75%).發(fā)芽9 d 后取樣，冷凍干燥后用于多酚物質(zhì)及抗氧化活性測定.

1.2.2 苦蕎芽長及鮮重的測定.

從光照組與黑暗組中各取樣品3 組，每組10 株，去除根和外殼，用直尺測量芽長，并用濾紙將苦蕎芽表面的水吸干再稱量鮮重.

1.2.3 多酚類物質(zhì)的提取.

本研究在文獻［17］的方法上進行調(diào)整:先將苦蕎芽進行冷凍干燥，研磨成細粉，取10 mg 的樣品，精密稱定，精密加入15 mL 含10%磷酸(0.1%)的甲醇，在室溫下旋渦振蕩5 min，并在37 ℃培養(yǎng)箱中存儲3 h，且每隔1 h 旋渦振蕩5 min;之后在1 000 g離心5 min 后，用于抗氧化活性與多酚類物質(zhì)的高效液相色譜測定.

1.2.4 多酚類物質(zhì)的檢測.

多酚類物質(zhì)檢測的色譜條件為:Kromasil 100-5 C18 色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μM);柱溫，40℃;進樣量，20 μL;檢測波長，350 nm;流動相A，甲醇∶ 水∶ 乙酸(5∶ 92.5∶ 2.5，V/V/V);流動相B，甲醇∶ 水∶ 乙酸(95∶ 2.5∶ 2.5，V/V/V);流速為1 mL/min;洗脫程序為:0.01 ～55 min，0% ～80%;55.01 min，0%;65 min，stop.采用外標(biāo)一點法計算多酚類物質(zhì)的含量.

1.2.5 DPPH 清除率的測定.

準(zhǔn)確稱取12.4 mg DPPH 于100 mL 容量瓶內(nèi)，用無水甲醇定容，配成0.124 mg/mL 的DPPH 貯備液，避光保存(0 ～4 ℃).取“1.2.3”項中上清液稀釋成系列濃度梯度的樣液，再進行下列操作:

1)吸取4.0 mL DPPH 溶液于10 mL 試管中，加入1.0 mL 無水甲醇，搖勻，反應(yīng)30 min 后，以無水甲醇為參比，并于波長517 nm 處測吸光值，記為Ao.

2)吸取4.0 mL 無水甲醇于10 mL 試管中，加入1.0 mL 樣液，搖勻，反應(yīng)30 min 后，以無水甲醇為參比，并于波長517 nm 處測吸光值，記為Ac.

3)吸取4.0 mL DPPH 溶液于10 mL 試管中，加入1.0 mL 樣液，搖勻，反應(yīng)30 min 后，以無水甲醇為參比，并于波長517 nm 處測吸光值，記為As.

計算自由基清除率，

X=［1－(As－Ac)/Ao］%

同時，以樣液濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得IC50值(清除率為50%時，抗氧化劑的濃度值).

1.2.6 數(shù)據(jù)分析.

芽長和鮮重重復(fù)實驗3 組，采用DPS 7.05 軟件進行顯著性分析.以多酚類物質(zhì)含量為自變量，運用在線分析軟件MetaboAnalyst 2.0(www.metaboanalyst.ca)進行數(shù)據(jù)處理，先將數(shù)據(jù)autoscaling，再進行主成分分析和聚類分析(ward，Euclidean).

2 結(jié)果與分析

2.1 蕎麥芽的生長

光照/黑暗條件下蕎麥芽的生長情況如表1 所示.表1 中，黑暗組的芽長和鮮重均大于光照組，且差異顯著.說明光照不利于芽長和鮮重的增加，此與Li 等［17－18］的研究結(jié)果一致.

表1 光照/黑暗條件下的芽長和鮮重

2.2 多酚類物質(zhì)的含量

10 種混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖1 所示，在本實驗條件下檢測出10 個主要峰，依次為:綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、葒草素、異葒草素、阿魏酸、牡荊素、蘆丁、槲皮素、山奈酚，保留時間分別為:16.865、19.915、26.332、27.148、27.598、28.198、29.498、32.315、41.215、45.602 min.10 種標(biāo)準(zhǔn)品的混合物能完全分離，峰形較好，沒有拖尾現(xiàn)象.樣品的光照組色譜圖和黑暗組色譜圖如圖2、3 所示，由圖可見，10 種多酚類物質(zhì)均能被檢測，且分離效果較好.

圖1 10 種混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 光照組樣品色譜圖

圖3 黑暗組樣品色譜圖

苦蕎芽樣品中的黃酮和酚酸類物質(zhì)含量測定結(jié)果如表2 所示.由表2 知，黑暗組樣品的槲皮素和山奈酚的含量高于光照組，且差異極顯著.綠原酸、對香豆酸、葒草素、異葒草素、阿魏酸、牡荊素和蘆丁在光照組樣品中的含量大于黑暗組，存在極顯著差異.而光照組樣品中的咖啡酸含量與黑暗組差異不顯著.說明苦蕎芽在光照條件下，發(fā)芽9 d 后槲皮素和山奈酚的含量降低，而對咖啡酸影響不大，其余7 種物質(zhì)的含量增加.

表2 苦蕎芽中黃酮類和酚類物質(zhì)的含量

2.3 主成分分析

主成分分析是一種降維分析方法，其原理是:設(shè)法將原來變量重新組合成一組新的互相無關(guān)的幾個綜合變量，同時根據(jù)實際需要從中取出幾個較少的綜合變量盡可能多地反映原來變量的信息的統(tǒng)計方法.

由圖4A 可知，前2 個主成分能解釋原變量91.2%的信息，其中，主成分一能解釋原變量的82.5%;主成分二能解釋8.7%.在PC1 上光照組(L)和黑暗組(D)能完全分離，說明光照對苦蕎多酚類成分有顯著影響.結(jié)合圖4B 可知，槲皮素和山奈酚在PC1 上有較大的負貢獻，咖啡酸呈較小的正貢獻，其余7 種物質(zhì)呈較大正貢獻，此表明光照組樣品的槲皮素和山奈酚含量低于黑暗組，其余物質(zhì)含量高于黑暗組.

圖4 主成分得分圖(A)及主成分載荷圖(B)

2.4 聚類分析

聚類分析是指把相似的對象通過靜態(tài)分類的方法分成不同的組別或者更多的子集，這樣讓在同一個子集中的成員對象都有相似的一些屬性.

本實驗采用ward 法和歐氏距離進行聚類分析，結(jié)果如圖5 所示.

圖5 聚類分析圖

由圖5 可知，苦蕎芽樣品在黑暗和光照條件下的多酚類物質(zhì)含量差異性顯著，此結(jié)論與主成分分析結(jié)果一致.

2.5 抗氧化性

經(jīng)測定得光照組/黑暗組自由基清除率(y)與其系列濃度(x)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為:

光照組，

y=25178x+7.9802，R2=0.9987;

黑暗組，

y=20925x+5.9353，R2=0.9965.

由此得，光照組IC50=1.6689 mg/mL，黑暗組IC50=2.1058 mg/mL.說明在第9 d 時，光照組樣品的抗氧化活性比黑暗組大.

3 討 論

3.1 光照對苦蕎芽形態(tài)指標(biāo)的影響

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)芽時間的增加，芽長和鮮重都將逐漸增加，且黑暗組的芽長和鮮重均顯著大于光照組［17－18］.本實驗結(jié)果表明，黑暗組的芽長和鮮重均大于光照組，且差異顯著，與前人研究結(jié)果一致.寧嬋娟［19］等人認為，判斷植物性狀最直接的一類指標(biāo)是其形態(tài)指標(biāo)，而其中最主要的就是芽長和根長.所以從黑暗組的芽長和鮮重都大于光照組可以看出，光照不利于苦蕎芽的生長和鮮重的增加，而黑暗條件有利于苦蕎芽的生長和物質(zhì)積累.

3.2 光照對苦蕎芽抗氧化活性的影響

Tsurunaga 等［16］比較了不同光質(zhì)條件下苦蕎芽抗氧化活性的差異，結(jié)果表明適當(dāng)?shù)墓庹諚l件可提高苦蕎芽的抗氧化活性，并認為是與花青素含量的增加有關(guān).本試驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽9 d 光照組樣品的抗氧化活性比黑暗組強.苦蕎抗氧化活性主要與其中的酚類、花青素、維生素C 等含量密切相關(guān)，本實驗光照組樣品中綠原酸、對香豆酸、葒草素、異葒草素、阿魏酸、牡荊素和蘆丁的含量顯著大于黑暗組，此可能是苦蕎芽抗氧化活性增強的原因之一.保留時間為31.265 min 和35.765 min 并有含量較高的未知成分，且光照條件下其峰面積均顯著提高，這可能也是苦蕎芽抗氧化活性增加的原因之一，此有待進一步采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)及對照品確定其分子結(jié)構(gòu).

3.3 光照對苦蕎芽多酚類物質(zhì)含量的影響

蕎麥發(fā)芽后，其多酚類成分含量發(fā)生復(fù)雜的變化.Li 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)芽時間的增加，其綠原酸、葒草素、異葒草素、牡荊素、異牡荊素和蘆丁的含量逐漸增加.光是影響生物量和次級代謝產(chǎn)物合成的重要因素［20－25］，本實驗比較了光照條件下與黑暗條件下苦蕎芽多酚類物質(zhì)的含量差異，結(jié)果表明光照對苦蕎芽多酚類成分的積累有顯著的影響.

4 結(jié) 論

光照對苦蕎芽中多酚類物質(zhì)及抗氧化活性有重要的影響.相較于黑暗條件，光照條件不利于苦蕎芽長和鮮重的增加，但有利于苦蕎芽中綠原酸、對香豆酸、葒草素、異葒草素、阿魏酸、牡荊素和蘆丁含量的提高，且其抗氧化活性也比黑暗條件下顯著增高.

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