兩種方法檢測LGC盲樣及效果探討

韓毅 彭浩

兩種方法檢測LGC盲樣及效果探討

韓毅 彭浩

目的 檢測LGC盲樣中的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌并對過程和結(jié)果進(jìn)行探討。方法 ①分離培養(yǎng)法。②實時熒光PCR法。結(jié)果 兩者均檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。結(jié)論 兩種方法的有效結(jié)合對目標(biāo)菌檢出有更重要的意義。

盲樣；小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌；分離培養(yǎng)法；實時熒光PCR法

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是一種人獸共患的腸道病原菌，20世紀(jì)80年代才受到人們的重視，不少地區(qū)耶氏菌引起的胃腸炎和嚴(yán)重腹瀉，比痢疾還多。1981年我國才發(fā)現(xiàn)此病，通過全國性調(diào)查和研究，發(fā)現(xiàn)其在我國的分布非常廣泛，80年代中期證實過曾有兩次大流行[1]。本菌是一種嗜冷菌，在0～4℃仍能繼續(xù)繁殖并產(chǎn)生毒素。在冰箱內(nèi)存放的污染該細(xì)菌的食品對人仍具有感染性[2]。鑒于小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的危害性，很多國家都已將該菌列為食品的常規(guī)檢測項目。本檢測中心為了提高中心實驗室的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢測能力，向英國LGC申請該菌的國際盲樣考核，并通過常規(guī)鑒定法和PCR法對該盲樣進(jìn)行了實驗。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 英國LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化學(xué)家實驗室)提供的凍干粉25 g。

1.2 培養(yǎng)基、試劑及儀器

1.2.1 分離培養(yǎng)法的培養(yǎng)基、試劑及儀器 改良磷酸鹽緩沖液(PSB)、CIN-1培養(yǎng)基、改良Y培養(yǎng)基、改良克氏雙糖培養(yǎng)基、尿素酶、動力半固體、糖發(fā)酵管由北京陸橋試劑有限公司提供；API鑒定系統(tǒng)、API-20E生化試劑條及其配套試劑，VITEK2全自動細(xì)菌鑒定儀及VITEK2-GN鑒定卡購自法國梅里埃公司。

1.2.2 實時熒光PCR法試劑及儀器 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌核酸測定試劑盒 (實時熒光PCR法)購自上海之江生物科技有限公司；AB 7500 FAST型Real-Time PCR儀購自美國杜邦公司。

1.3 方法

1.3.1 分離培養(yǎng) 無菌操作稱取25 g凍干粉放入裝有225 mL改良磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)袋中，26℃增菌72 h，參照食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢驗方法(GB/T4789.8－2008)[3]進(jìn)行。取增菌液作堿處理，分別接種到CIN-1平板、改良Y平板上，26℃培養(yǎng)48 h。挑取可疑菌落接種改良克氏雙糖，并做初篩的生化鑒定(尿素酶、鼠李糖、26℃和37℃培養(yǎng)下動力)，符合以上反應(yīng)者用API－20E生化試劑條和VITEK2全自動細(xì)菌鑒定儀做進(jìn)一步的生化鑒定。

1.3.2 實時熒光PCR法 從上述分離培養(yǎng)的26℃增菌72 h的改良磷酸鹽緩沖液中取出2 mL，用離心管13 000 rpm離心2 min，去盡上清；在沉淀中加入100 μL DNA提取液充分混勻，沸水浴10 min；13 000 rpm離心5 min，取上清4 μL與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌核酸熒光PCR檢測混合液35 μL、內(nèi)部對照品1 μL、酶(Taq+UNG)0.4 μL，振蕩混勻數(shù)秒，3 000 rpm離心數(shù)秒，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。設(shè)置循環(huán)參數(shù)：37℃×2 min；94℃×2 min；再按93℃×15 sec→60℃×60 sec，循環(huán)40次，單點熒光檢測在60℃。同時進(jìn)行陽性對照品、陰性對照品試驗。循環(huán)結(jié)束后，觀察熒光曲線。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果 在CIN－1瓊脂平板上多為紅色、周圍帶較小透明環(huán)的菌落或紅色無透明環(huán)的菌落。所有菌落均較為圓整，但大小不一，雖都為紅色，但略有色差。在改良Y瓊脂平板上多為無色透明、不黏稠的菌落，大小不一，也是略有色差。根據(jù)經(jīng)驗推斷，該盲樣中混入了除目標(biāo)菌外的其他雜菌。因此，對CIN-1平板、改良Y平板上的多個不同菌落均進(jìn)行分離純化，挑取形態(tài)最接近目標(biāo)菌的菌株進(jìn)行鏡檢和生化初篩。初篩的生化鑒定中，改良克氏雙糖接種管產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、尿素酶陽性、鼠李糖陰性、26℃培養(yǎng)下有動力，37℃培養(yǎng)下無動力。將該疑似菌落用API-20E生化試劑條和VITEK2全自動細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定。兩者鑒定結(jié)果均為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，API-20E可靠性為95%(表1)，VITEK2可靠性為99%(表2)。

表1 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌API－20E生化試劑條鑒定結(jié)果

表2 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌VITEK2全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定結(jié)果

2.2 實時熒光PCR結(jié)果 (圖1) 盲樣的熒光曲線在21個循環(huán)處呈光滑的上升拋物線，峰值出現(xiàn)在在Delta Rn 1.0e+006左右處。陽性對照品的熒光曲線在10個循環(huán)處呈光滑的上升拋物線，峰值同樣出現(xiàn)在在Delta Rn 1.0e+006左右處。陰性對照品則呈不規(guī)則的折線圖。比較陽性對照品的熒光曲線和盲樣的熒光曲線可以判斷盲樣為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢出。

圖1 實時熒光PCR結(jié)果

3 結(jié)論

我國現(xiàn)階段食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測主要以傳統(tǒng)分離培養(yǎng)為主，它是所有檢測方法的金標(biāo)準(zhǔn)。但是按照國標(biāo)上的方法進(jìn)行培養(yǎng)時間較長，檢測完成周期也較長。而且從CIN-1平板、改良Y平板上的菌落形態(tài)來看，有些非目標(biāo)菌同國標(biāo)上小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的描述也很吻合。在此次的盲樣考核中，作者就受到了很大的干擾。在CIN-1平板上分離出與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌菌落形態(tài)很相似的一種菌，通過染色鏡檢，初步生化，最終生化，才確定其是一種大腸埃希氏菌。由于此類雜菌和目標(biāo)菌的競爭，導(dǎo)致目標(biāo)菌在選擇性平板上生長的很少，這就給分離檢出帶來了困難。實時熒光PCR方法由于具有實時監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程、快速、特異性強(qiáng)以及靈敏性高等優(yōu)點而成為國外目前檢驗該菌的主要方法。但由于食品體系較復(fù)雜且雜菌率較高以致檢出率較低，所以在使用實時熒光PCR方法檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌之前增菌是十分必要的[4]。在經(jīng)過PSB的增菌以后，使用實時熒光PCR進(jìn)行擴(kuò)增，從熒光曲線結(jié)果來看，單位容積內(nèi)的DNA數(shù)量有明顯的呈指數(shù)級的擴(kuò)增現(xiàn)象，而將未經(jīng)增菌的PSB凍干粉溶液擴(kuò)增后結(jié)果顯示基本為陰性。將這兩者直接轉(zhuǎn)種至CIN-1平板上時，前者跟后者一樣都很難直接分離出目標(biāo)菌，原因可能是PSB在增菌的過程中選擇性并不是很強(qiáng)，目標(biāo)菌和雜菌都在大量的生長，而雜菌在CIN-1平板上的生長又優(yōu)于目標(biāo)菌，導(dǎo)致平板上的目標(biāo)菌菌落過于稀少，這就給分離檢出帶來了困難。而將PSB增菌液進(jìn)行堿處理后的效果就好的多，在CIN-1平板上也較容易分離出目標(biāo)菌。因為耶爾森氏菌對弱堿具有較高的抵抗力，用弱堿液迅速處理15 s，可以殺死大部分不耐堿的其他細(xì)菌，能提高小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢出率[5]。

綜上所述，實時熒光PCR法檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌速度快，周期短，但是普遍共知的是PCR法雖然靈敏度高，但是易出現(xiàn)結(jié)果的假陽性和假陰性。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)雖然周期長，操作繁瑣且要求檢測人員有豐富的經(jīng)驗，但是其檢測的穩(wěn)定性和把握性也更高。目前的有利條件是引進(jìn)了全自動生化鑒定儀，這就給后期的確證帶來了極大的方便和保證。兩種方法均有自己的優(yōu)勢與不足，如何將兩種方法有機(jī)的結(jié)合，創(chuàng)造出一套切實有效的操作模式，為我們的檢測工作服務(wù)，這還有待于我們的進(jìn)一步思考和研究。

[1]于恩庶.中國小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌病研究進(jìn)展[J].中華流行病學(xué)雜志，2000，21(6)：453-455．

[2]龔霄，陳盼.肉中革蘭氏陰性食源性致病菌[J].肉類研究，2008，22(5)：32-46.

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部.食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008．

[4]牛蕾，祝長青，周光宏，等.小腸結(jié)腸炎耶爾森菌前增菌方式的選擇[J].食品科學(xué)，2011，32(5)：168-171．

[5]張昕，張惠媛，汪琦，等.小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測[J].檢驗檢疫科學(xué)，2008，18(6)：23-26

Objective To detect Yersinia enterocolitica in LGC blind sample and probe into the process and results.Methods ①Isolated culture method.②Real-time fluorescence PCR method.Results Yersinia enterocolitica was detected by both methods.Conclusion The effective combination of the two methods has more important significance to detect Yersinia enterocolitica.

Blind sample；Yersinia enterocolitica；Isolated culture；Real-time fluorescence PCR method

2014-05-06)

1005-619X(2015)01-0087-03

10.13517/j.cnki.ccm.2015.01.046

214023無錫市疾病預(yù)防控制中心