DNA條形碼技術(shù)在病原真菌分類鑒定中的應(yīng)用

劉娜　李夢臻

摘要：病原真菌是一種具有致病性的真菌，對植物有極大的危害。DNA條形碼技術(shù)是通過對足夠變異、短、能夠作為標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進行分析，并進一步對未知物種進行快速、高效地分類和鑒定或者發(fā)現(xiàn)新物種的一項新技術(shù)。在介紹DNA條形碼技術(shù)概況的基礎(chǔ)上，對DNA條形碼技術(shù)在病原真菌分類鑒定中的應(yīng)用前景進行展望，以推進我國病原真菌DNA條形碼在相關(guān)研究和應(yīng)用領(lǐng)域的發(fā)展。

關(guān)鍵詞：DNA條形碼；病原真菌；分類鑒定

中圖分類號： Q949.32；S432.4+4 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0010-03

真菌是自然界中一類龐大而廣泛的生物類群，已確認(rèn)1萬余屬12萬余種[1-2]。病原真菌（Pathogenic fungi）是一種具有致病性的真菌，分布廣泛，尤其在植物中普遍存在，70%～80%的植物病害均由病原真菌引起，對植物造成極大的危害，嚴(yán)重影響生態(tài)平衡[3]。病原真菌能使花草及農(nóng)作物的質(zhì)量受到較大程度損害，產(chǎn)量明顯下降[4]。對物種進行正確的分類鑒定，識別每一個生物體的內(nèi)部信息，如分類地位、生理生化指標(biāo)和危害程度等，可以及時采取一定的措施阻止病原真菌危害[5]；因此，病原真菌分類鑒定具有重要意義。

1 病原真菌傳統(tǒng)分類鑒定方法的不足之處

病原真菌的傳統(tǒng)分類和鑒定主要以微觀形態(tài)特征、生長特性及生理生化指標(biāo)為依據(jù)，對病原真菌進行形態(tài)學(xué)、生理及生化特征等分析，并對照已有的研究資料判斷它所處的分類地位以及不同菌株之間的親緣關(guān)系。采用傳統(tǒng)分類方法進行病原真菌鑒定費時、耗力、復(fù)雜且繁亂[6]，其不足之處具體如下所示。

1.1 病菌形態(tài)簡單，分類鑒定較為困難

病原真菌形態(tài)簡單，有些菌株僅用形態(tài)觀察進行分類鑒定很難，如尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）和串珠鐮孢菌（F. moniliforme）的分生孢子都呈鐮刀狀，兩端漸尖，菌落及顯微形態(tài)特征相似，特別是有時培養(yǎng)物不典型或不產(chǎn)孢，僅用傳統(tǒng)方法鑒定更加困難[7]。朱桂寧等對25個病害標(biāo)樣的12個炭疽病原菌株進行形態(tài)觀察和生物學(xué)特征研究發(fā)現(xiàn)，炭疽病病原菌結(jié)構(gòu)比較單一，傳統(tǒng)生物學(xué)特性及致病性基本一致，病原菌形態(tài)和生物學(xué)特征均無明顯差異[8]。

1.2 病原真菌形態(tài)特征易受外界環(huán)境影響

病原真菌形態(tài)特征易受培養(yǎng)條件和其他因素影響，生長特性和生理生化指標(biāo)不穩(wěn)定[9]。如炭疽菌菌絲生長和產(chǎn)孢受溫度、pH值等生態(tài)條件和碳源、氮源等營養(yǎng)條件的影響較大[10]。

2 DNA條形碼技術(shù)概述及其在病原真菌分類鑒定中的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)技術(shù)和一些相關(guān)學(xué)科的飛速發(fā)展以及對DNA序列認(rèn)識的不斷增加，人們提出利用DNA條形碼進行病原真菌分類鑒定的設(shè)想[11]。從遺傳本質(zhì)探索病原真菌的親緣關(guān)系，以DNA條形碼技術(shù)替代傳統(tǒng)分類方法進行病原真菌鑒定，為病原真菌的分類鑒定構(gòu)建了新前景[12]。

2.1 DNA條形碼技術(shù)簡介

2003年，Herbert等提出DNA條形碼概念[13]。生命DNA條形碼協(xié)會對DNA條形碼的定義是：DNA條形碼為一短段能夠高效鑒定物種的DNA標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域[14]。DNA條形碼技術(shù)通過對2個來自不同生物個體的較短同源DNA序列進行PCR擴增和測序，對序列進行多重比對和聚類分析，將該個體精確定位到一個已描述的分類群中[15]。DNA條形碼技術(shù)可準(zhǔn)確地辨別形態(tài)分類難以區(qū)分的病原真菌，任何生長發(fā)育時期的任何形態(tài)均可使用該技術(shù)，是傳統(tǒng)鑒定方法所不能比擬的[16]，且易于構(gòu)建統(tǒng)一的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，可一次性快速鑒定大量樣本或者發(fā)現(xiàn)新物種[17]，彌補了傳統(tǒng)分類鑒定方法的不足，這為分類學(xué)研究提供了標(biāo)準(zhǔn)快速的物種鑒定方法，并逐漸成為病原真菌分類學(xué)領(lǐng)域進展最迅速的前沿學(xué)科[18]。

DNA條形碼需具備以下特征特性：（1）具有可以區(qū)分不同物種的足夠變異性和系統(tǒng)進化信息[19]，同時種間存在明顯的遺傳變異，種間變異超過種內(nèi)變異[20]；（2）在普遍的分類群中均存在，并且有利于DNA提取和PCR擴增；（3）具有高度保守的區(qū)域，便于設(shè)計通用引物[21]；（4）包含充分的系統(tǒng)進化信息，便于確認(rèn)物種的系統(tǒng)地位[22-23]。

2.2 DNA條形碼技術(shù)在病原真菌分類鑒定中的應(yīng)用

DNA條形碼技術(shù)利用病原真菌有足夠變異、容易擴增、較短的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段對物種進行分類鑒定[24]，其中， CO1和ITS等已被提出較適合作為備選片段[25]。

2.2.1 CO1線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ在病原真菌中的應(yīng)用 2003—2004年，已有少量學(xué)者使用CO1對真菌進行研究[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，利用病原真菌CO1一段長度為648 bp（5末端開始第58～705位）的基因片斷，能夠在DNA水平上成功地將物種進行分類[27]，這被認(rèn)為是每種生物都具有的獨一無二的DNA條形碼編碼理想?yún)^(qū)域[28]。CO1序列擁有更多的系統(tǒng)發(fā)育信號，更適合于分析親緣關(guān)系密切的分類類群[29]。Seifert等對青霉屬（Penicillium）的58個物種370余份樣本CO1序列進行擴增，對PCR產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)了4個屬，并認(rèn)為CO1序列適合作為青霉屬分類鑒定的DNA條形碼[5]。Nguyen等利用菌物的CO1序列進行研究，發(fā)現(xiàn)錘舌菌屬（Leohumicola）的3個新種，CO1序列作為該類群有效的物種分類鑒定條碼，可以發(fā)現(xiàn)菌物的隱藏種和新種[30]。Martin對疫霉屬（Phytophtora spp.）CO1和CO11基因進行研究發(fā)現(xiàn)，利用CO1和CO11基因相結(jié)合對物種進行分類鑒定，比單一考慮ITS序列更加穩(wěn)定可靠[31]。

2.2.2 ITS 核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)在病原真菌分類鑒定中的應(yīng)用 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)是位于18S rDNA和5.8S rDNA之間及5.8S rDNA和28S rDNA之間的區(qū)域片段[9]，是目前真菌物種分辨率最高的單一DNA片段。該基因片段雖然較短，但人們可以從不太長的序列中獲得足夠的信息，有更高的PCR擴增成功率，進行測序和克隆也比較容易[32]。種內(nèi)的不同菌株之間高度保守，但在種間變化極大，近緣的種屬也能夠通過ITS序列上的不同而加以鑒別。Landeweert等認(rèn)為，真菌通過ITS區(qū)域比對，序列相似性小于95%，鑒別為同科；序列相似性大于95%且小于99%，鑒別為同屬；序列相似性大于99%，鑒別為同種[33]。沒有一種單一線粒體基因在病原真菌分類鑒定上比ITS基因更加合適[34]。

段維軍等對輪枝菌的ITS片段進行研究，成功區(qū)分了所涉及的10個種，ITS序列是輪枝菌理想的DNA條形碼，能對物種或未知菌進行準(zhǔn)確分類鑒定[35]。Bryn等通過ITS序列對傘菌亞門（Agaricomycotina） 進行研究，發(fā)現(xiàn)ITS基因比CO1基因更適合作為該類群的DNA條形碼[36]。Boyanton等對60株念珠菌屬（Candida）進行ITS2序列擴增，并進行菌種分類鑒定，檢測出8種不同菌株，其結(jié)果與生化檢測和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，且所用時間均比兩者短[37]。Sert等利用ITS序列和18S rDNA片段，對古代大理石紀(jì)念碑中的250個黑色真菌樣品進行研究，發(fā)現(xiàn)其中有99種不同的真菌菌株，它們?nèi)际亲幽揖男路N[38]，利用DNA條形碼技術(shù)對物種進行分類鑒定，不受物種生長時期的限制。Feau等對8個不同的柵銹菌（Melampsora）物種的形態(tài)學(xué)特征和DNA條形碼進行比較，糾正加拿大標(biāo)本館的錯誤定名，證明Melampsora aecidioides與柵銹菌屬的其他4個種密切相關(guān)但不相同[39]。李依韋等應(yīng)用ITS序列進行腐霉菌（Pythium）的分子鑒定及菌群之間的系統(tǒng)發(fā)育分析，從形態(tài)學(xué)角度對腐霉菌的分類起到了修正和補充的作用[40]。

3 展望

目前，病原真菌的分類鑒定方法多種多樣。依據(jù)病原真菌的形態(tài)特征、生長特性以及生理生化指標(biāo)進行分類鑒定的傳統(tǒng)方法，由于受到許多客觀因素影響，測定指標(biāo)往往不穩(wěn)定，給病原真菌的分類鑒定帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展和不斷成熟，一種高效的標(biāo)準(zhǔn)化分子生物學(xué)鑒定體系——DNA條形碼技術(shù)應(yīng)運而生[41-42]。DNA條形碼技術(shù)為探測未知物種和識別病原菌提供了大量數(shù)據(jù)，成為闡明宿主寄生和共生關(guān)系的一種有效的工具[43]。需要說明的是，DNA條形碼技術(shù)也有一定的局限性，適用于所有物種的DNA條形碼是基本不存在的，在對不同物種類群進行分類鑒別時需要用不同的目的基因[14]。DNA條形碼技術(shù)是傳統(tǒng)鑒定方法強有力的補充，有著其他方法不可比擬的優(yōu)勢，已在病原真菌的研究中得到廣泛應(yīng)用，已經(jīng)成為病原真菌分類鑒定的有力工具，解決了許多重要的生物問題，為國家經(jīng)濟和生態(tài)環(huán)境建設(shè)、生物多樣性維護、生物安全保障、物種保護等科學(xué)領(lǐng)域開辟了一個新的方向[24]。

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