不同分子標(biāo)記在菠蘿中檢測效率的比較

王健勝 賀軍虎 陳華蕊 陳業(yè)淵

摘要：以來自不同國家的47份菠蘿[Ananas comosus （L.） Merr]種質(zhì)為材料，對(duì)ISSR、SSR、SCoT和RAPD 4種標(biāo)記在菠蘿基因組中的檢測效率進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，不同分子標(biāo)記檢測效率差異較大，引物篩選率以RAPD最高，達(dá)到了47.06%；擴(kuò)增總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)均以ISSR最高，分別為238條和222條；而多態(tài)性條帶百分比最高的是SSR，達(dá)到了92.88%；在有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis基因多樣性指數(shù)（H）、Shannons信息指數(shù)（I）和多態(tài)性信息含量（PIC）方面，SCoT和SSR綜合表現(xiàn)要優(yōu)于其他標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：菠蘿[Ananas comosus （L.） Merr]；分子標(biāo)記；檢測效率

中圖分類號(hào)：S668.3；Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）11-2676-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.031

Comparison on the Detection Efficiency of Different Types of

Molecular Markers in Pineapple

WANG Jian-sheng1，HE Jun-hu2，CHEN Hua-rui2，CHEN Ye-yuan2

（1. Pingdingshan University， Pingdingshan 467000， Henan， China；

2. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou 571737， Hainan， China）

Abstract： Taking forty seven pineapple germplasms originated from the different countries as material， the detection efficiency in pineapple genome was compared for four types of molecular marker including ISSR，SSR，SCoT and RAPD. Results showed that there was the great difference among the different types of molecular markers. The higher ratio of primer screening was found for RAPD with 47.06%； The greater number of total producing bands and polymorphic bands was all detected for ISSR with 238 and 222，respectively； SSR had the higher percentage of polymorphic bands to the total bands，and its percentage of polymorphic bands reach to 92.88%. For the effective allele number， Neis gene diversity index，Shannons information index and polymorphism information content，SCoT and SSR performed better than other molecular markers.

Key words： pineapple[Ananas comosus （L.） Merr]； molecular marker； detection efficiency

菠蘿[Ananas comosus （L.） Merr]屬鳳梨科鳳梨屬，原產(chǎn)于南美洲，是一種重要的多年生常綠草本果樹，與香蕉、芒果、椰子合稱世界四大熱帶水果。近年來，隨著世界菠蘿需求量的大幅增加以及菠蘿產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，越來越多的國家開始重視對(duì)菠蘿的基礎(chǔ)研究。分子標(biāo)記作為一種穩(wěn)定、高效、便利的研究技術(shù)在許多植物研究中已得到了廣泛的應(yīng)用。與其他主要農(nóng)作物相比，分子標(biāo)記應(yīng)用于菠蘿的研究相對(duì)較晚，雖然如此，利用不同分子標(biāo)記國內(nèi)外學(xué)者針對(duì)菠蘿也作了一些初步較好的研究。目前，包括AFLP[1，2]、RFLP[3]、RAPD[4]、SSR[5]、SCoT[6]和SRAP[7]等多種分子標(biāo)記已被較好地應(yīng)用于菠蘿研究中。

由于不同分子標(biāo)記的設(shè)計(jì)特性決定了其在菠蘿基因組中具有不同的檢測效率，而比較不同分子標(biāo)記的檢測效率對(duì)菠蘿研究中分子標(biāo)記方法的選擇以及菠蘿相關(guān)遺傳研究都極為關(guān)鍵，但截至目前，有關(guān)此方面的研究仍未見報(bào)道。為此，利用RAPD、ISSR、SSR、SCoT對(duì)來自世界不同國家的多種菠蘿種質(zhì)進(jìn)行了研究，著重比較了不同分子標(biāo)記在菠蘿基因組中的檢測效率，以期為菠蘿分子標(biāo)記研究水平提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)共選用了47份菠蘿種質(zhì)，來源于世界上不同國家或地區(qū)，主要包括中國臺(tái)灣、中國海南、巴西、日本、印度尼西亞、澳大利亞、泰國、哥斯達(dá)黎加、毛里求斯。試驗(yàn)材料由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。

1.2 DNA提取

每份材料隨機(jī)選取10～15株單株的幼嫩葉片等量混合，采用改良的SDS法[8]混合提取基因組總DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定濃度后，稀釋至適合工作濃度備用。

1.3 分子標(biāo)記檢測

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf PCR擴(kuò)增儀上完成。PCR反應(yīng)總體積20 μL，反應(yīng)體系的組成根據(jù)不同類型分子標(biāo)記的特點(diǎn)對(duì)基因組DNA、引物、10×PCR緩沖液、dNTPs、Taq酶和ddH2O進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。PCR擴(kuò)增程序也根據(jù)不同分子標(biāo)記特點(diǎn)確定。對(duì)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物主要采用6%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測，其他標(biāo)記則通過1.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

以0、1、9統(tǒng)計(jì)SCoT擴(kuò)增帶型，在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“9”，并建立分子數(shù)據(jù)矩陣。采用POPGEN32軟件估算SCoT標(biāo)記的主要遺傳多樣性參數(shù)，包括引物擴(kuò)增總條帶數(shù)（TNB）、多態(tài)性條帶數(shù)（NPB）、多態(tài)性條帶百分比（PPB）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis基因多樣性指數(shù)（H）、Shannons信息指數(shù)（I）和多態(tài)性信息含量（PIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子標(biāo)記多態(tài)性引物在菠蘿中的篩選率比較

利用兩個(gè)表型性狀差異明顯的菠蘿種質(zhì)對(duì)不同類型分子標(biāo)記進(jìn)行了篩選，具體信息見表1。從表1可以看出，不同分子標(biāo)記在菠蘿種質(zhì)中的篩選率差異較大，其中RAPD標(biāo)記的篩選率最高，達(dá)到了47.06%，其次是ISSR標(biāo)記，篩選率為43.33%，SSR標(biāo)記和SCoT標(biāo)記的篩選率都較低，分別為28.57%和24.44%。這種篩選率的狀況在一定程度上也反映了不同分子標(biāo)記的特點(diǎn)及差異，作為隨機(jī)擴(kuò)增標(biāo)記的RAPD和ISSR，由于不具有種屬特異性而具有很高的多態(tài)性引物篩選率，而具有特異種屬限制的SSR標(biāo)記其篩選率就相對(duì)較低，雖然SCoT也是一種隨機(jī)擴(kuò)增引物，但其篩選率卻較低，這可能與其設(shè)計(jì)特性有關(guān)。

2.2 不同分子標(biāo)記在菠蘿基因組中的擴(kuò)增信息比較

不同分子標(biāo)記在菠蘿基因組中擴(kuò)增差異較大，從表2可知，不同分子標(biāo)記在擴(kuò)增總條帶、多態(tài)性條帶及多態(tài)性條帶百分比方面都存在明顯差異。在擴(kuò)增總條帶方面，ISSR表現(xiàn)最好，其單個(gè)引物最多擴(kuò)增出了238個(gè)條帶，其平均擴(kuò)增條帶數(shù)也達(dá)到了140.86，這在4種類型標(biāo)記中都是最高的；其次是RAPD標(biāo)記，其單個(gè)引物擴(kuò)增條帶數(shù)平均為123.57；SCoT標(biāo)記和SSR標(biāo)記平均擴(kuò)增條帶數(shù)相對(duì)較低，其中SSR標(biāo)記最差，其單個(gè)引物平均擴(kuò)增條帶數(shù)只有80.75。4種標(biāo)記在多態(tài)性條帶方面與擴(kuò)增總條帶數(shù)有所不同，單個(gè)引物擴(kuò)增多態(tài)性條帶數(shù)平均值最高為124.57，最低只有75，4種標(biāo)記單個(gè)引物擴(kuò)增平均多態(tài)性條帶數(shù)從大到小順序?yàn)镮SSR、SCoT、RAPD、SSR。另外可以看出，每種分子標(biāo)記不同引物間無論是在擴(kuò)增總條帶數(shù)目還是在多態(tài)性條帶數(shù)目方面差異都很大。與擴(kuò)增條帶數(shù)不同，多態(tài)性條帶百分比可以比較綜合地反映出不同分子標(biāo)記的多態(tài)性檢測效率，從表2以看出，4種分子標(biāo)記間多態(tài)性條帶百分比差異較大，其中SSR的多態(tài)性條帶百分比最高，達(dá)到了92.88%，其次是ISSR和SCoT，其多態(tài)性條帶百分比比較接近，都在88%，RAPD多態(tài)性條帶百分比最低，只有78.49%。從以上分析可以看出，在菠蘿基因組擴(kuò)增方面，SSR和ISSR表現(xiàn)相對(duì)較好。

2.3 不同分子標(biāo)記主要遺傳多樣性參數(shù)比較

試驗(yàn)也對(duì)不同分子標(biāo)記的主要遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行了比較，具體見表3。從表3可以看出，不同分子標(biāo)記在3種主要遺傳參數(shù)方面差異較大。在有效等位基因數(shù)方面，4種標(biāo)記中RAPD表現(xiàn)最好，其平均值最大，達(dá)到了1.46，其次是SCoT標(biāo)記，其表現(xiàn)與RAPD十分接近，平均值也達(dá)到了1.45，ISSR的有效等位基因數(shù)最低，只有1.35；同時(shí)可以看出，每種標(biāo)記不同引物間有效等位基因數(shù)變化都較大，其中以SCoT和RAPD的變化為最大。在Neis基因多樣性指數(shù)方面，不同類型標(biāo)記間差異相對(duì)較小，其中SCoT的Neis基因多樣性指數(shù)最大，其次是SSR和RAPD，ISSR相對(duì)最小。4種標(biāo)記的Shannons信息指數(shù)介于前兩個(gè)參數(shù)之間，其中，SSR和SCoT的Shannons信息指數(shù)相對(duì)較大，都達(dá)到了0.41，RAPD為0.39，ISSR最小，只有0.36。從4種分子標(biāo)記主要遺傳多樣性參數(shù)來看，SCoT和SSR綜合表現(xiàn)相對(duì)較好。

2.4 不同分子標(biāo)記多態(tài)性信息量比較

多態(tài)性信息量是進(jìn)行分子標(biāo)記評(píng)價(jià)的重要參數(shù)，故試驗(yàn)對(duì)4種分子標(biāo)記的多態(tài)性信息量進(jìn)行了比較分析。從表4可以看出，不同分子標(biāo)記間多態(tài)性信息量變化都較大，其極差介于0.23～0.42之間，其中SCoT標(biāo)記變化最大，而ISSR標(biāo)記的變化最小。從多態(tài)性信息量的極值表現(xiàn)來看，SCoT和SSR的最大值表現(xiàn)最好，而RAPD的最小值表現(xiàn)最差。多態(tài)性信息量平均值可以較均衡地反映出不同分子標(biāo)記間的差異，可以看出SCoT標(biāo)記多態(tài)性信息量整體表現(xiàn)最好，其平均值達(dá)到了0.30，其次是SSR標(biāo)記，其平均值略低于SCoT，為0.29，而ISSR和RAPD標(biāo)記的多態(tài)性信息量較低，都為0.24。從4種分子標(biāo)記多態(tài)性信息量的綜合表現(xiàn)來看，SCoT和SSR相對(duì)最好。

3 小結(jié)與討論

分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用有效加快了菠蘿遺傳育種及其相關(guān)研究的進(jìn)展，而在分子標(biāo)記應(yīng)用中，基因組檢測效率是較為重要的一項(xiàng)內(nèi)容，同時(shí)它也是開展菠蘿其他相關(guān)遺傳研究的重要基礎(chǔ)。近年來，隨著新的分子標(biāo)記技術(shù)的不斷開發(fā)，越來越多的分子標(biāo)記被逐步應(yīng)用于菠蘿研究中，而不同分子標(biāo)記的設(shè)計(jì)特點(diǎn)決定了其在菠蘿基因組多態(tài)性檢測中具有特定的檢測效率，因此開展不同分子標(biāo)記在菠蘿中檢測效率的比較分析較為重要。試驗(yàn)對(duì)ISSR、SSR、SCoT、RAPD 4種分子標(biāo)記在菠蘿中的檢測效率進(jìn)行了比較分析，選取了可用于檢測效率比較的多種考查指標(biāo)，主要包括引物篩選率、基因組擴(kuò)增條帶數(shù)、多態(tài)性條帶百分比、有效等位基因數(shù)、Neis基因多樣性指數(shù)、Shannons信息指數(shù)和多態(tài)性信息含量，結(jié)果表明，各分子標(biāo)記在不同檢測指標(biāo)方面表現(xiàn)各有優(yōu)劣，例如，RAPD在引物篩選率方面表現(xiàn)最好，ISSR在擴(kuò)增條帶數(shù)方面最為突出，而SCoT和SSR的主要遺傳多樣性參數(shù)相對(duì)較高，因此，在利用分子標(biāo)記進(jìn)行菠蘿種質(zhì)研究時(shí)，應(yīng)該根據(jù)特定的研究目標(biāo)及研究條件等選擇適合的標(biāo)記類型，當(dāng)然多種類型分子標(biāo)記的有效結(jié)合無疑是獲得理想研究結(jié)果的有效途徑。關(guān)于不同分子標(biāo)記的效率比較分析，在其他如油菜[9]、葡萄[10]、中藥材[11]、柳枝稷[12]等上已開展了較多的研究，但與本研究相比，這些研究不僅選用的分子標(biāo)記類型較少，而且在分子標(biāo)記比較時(shí)選取的考察指標(biāo)少且單一，因此，本研究結(jié)果在為菠蘿分子標(biāo)記的高效利用提供重要科學(xué)依據(jù)的同時(shí)，對(duì)其他植物分子標(biāo)記的應(yīng)用及相關(guān)研究也具有一定的參考價(jià)值。

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