• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    煙草花葉病毒屬條形碼鑒定方法的建立

    2015-07-31 20:36:23張永江馬榮群辛言言黃粵
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年11期
    關(guān)鍵詞:鑒定

    張永江++馬榮群++辛言言++黃粵

    摘要:煙草花葉病毒屬病毒可侵染多種植物,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重危害。為建立該病毒屬的條形碼鑒定技術(shù),以該屬22個確定種的標(biāo)準(zhǔn)序列為憑證標(biāo)本序列,分析其保守區(qū)域,設(shè)計(jì)6對候選條形碼引物(Tobamo1-Tobamo6),其擴(kuò)增片段長度為200~1 240 bp。以田間樣本對引物進(jìn)行篩選,通過比較各引物的擴(kuò)增效率、測序成功率、獲得序列的親緣關(guān)系對引物的通用性和物種分辨率進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果表明,Tobamo6的通用性最高,擴(kuò)增率和測序成功率均為100%;物種分辨率良好,獲得序列的種內(nèi)種間變異可有效鑒定實(shí)際樣本中的辣椒輕斑駁病毒、煙草花葉病毒、番茄花葉病毒和黃瓜綠斑駁花葉病毒;可作為煙草花葉病毒屬的首選條形碼引物。

    關(guān)鍵詞:煙草花葉病毒屬(Tobamovirus);條形碼技術(shù);鑒定

    中圖分類號:S463.85 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2015)11-2624-04

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.016

    Development of Barcoding Technique for Identification of the Genus Tobamovirus

    ZHANG Yong-jiang1,MA Rong-qun2,XIN Yan-yan1,HUANG Yue2

    (1.Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China; 2.Qingdao Institute of Agricultural Science Research, Qingdao 266100, Shandong, China)

    Abstract: Plant viruses of Tobamovirus can infect many plants and is one of the most devastating threats to agricultural production. To develop barcoding technique for identification of genus Tobamovirus, the standard nucleotide sequences of twenty-two type species used as voucher specimen were analyzed by using the software Omiga 2.0, and six pair candidate barcoding primers Tobamo1-Tobamo6 were designed, which amplified 200~1 240 bp bands. These primers were tested by using field samples. Their universality and species resolution were compared during RT-PCR amplification rate, sequencing success rate and sequence phylogenetic relationship. The results demonstrated that Tobamo6 had the highest universality with 100% PCR amplification rate and sequencing success rate; and better species resolution, which can successfully identify four Tobamovirus viruses including Cucumber green mottle mosaic virus,Pepper mild mottle virus,Tobacco mosaic virus and Tomato mosaic virus from field samples. All this suggested Tobamo6 as the primary barcode for the identification of Tobamovirus viruses.

    Key words: Tobamovirus; barcoding technique; identification

    煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)為蕪菁黃花葉病毒目(Tymovirales)帚狀病毒科(Virgaviridae)成員;根據(jù)國際病毒分類委員會(International Committeeon Taxonomy of Viruses, ICTV)于2012年發(fā)布的最新病毒分類第九次報(bào)告,該病毒屬包含曼陀羅輕斑駁病毒(Brugmansia mild mottle virus, BrMMV)等25個確定種和苘麻黃花葉病毒(Abutilon yellow mosaic virus, AbYMV)、甜椒斑駁病毒(Bell pepper mottle virus, BPMoV)、仙人掌輕斑駁病毒(Cactus mild mottle virus, CMMoV)、黃瓜斑駁病毒(Cucumber mottle virus, CuMoV)、雞蛋果花葉病毒(Maracuja mosaic virus, MarMV)及Tropical soda apple mosaic virus (TSAMV)等6個暫定種[1]。同時(shí),該屬內(nèi)新的病毒種類還有增加的趨勢;而且該屬病毒的寄主范圍相當(dāng)廣泛,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來重大損失;因此,加強(qiáng)對該屬病毒的檢測鑒定具有重要意義[2]。國內(nèi)外采用直接觀測法、電鏡法、生物學(xué)測定法、血清學(xué)檢測及分子生物學(xué)檢測等方法[3]對該屬病毒進(jìn)行鑒定研究。隨著各地植物種質(zhì)資源的引進(jìn)和栽培條件的改變,對該屬病毒的檢測鑒定方法也提出了更高的要求。endprint

    生物條形碼技術(shù)是近年來出現(xiàn)的一種新的生物物種檢測鑒定技術(shù),由加拿大Guelph大學(xué)的分類學(xué)家Paul Hebert在2003年首次提出,其在物種標(biāo)準(zhǔn)化鑒定方面的優(yōu)勢已備受關(guān)注[4-6]。該技術(shù)利用基因組中一段通用的標(biāo)準(zhǔn)短序列對物種進(jìn)行鑒定。目前,動物種類鑒定中廣泛使用的是線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(COI)基因;植物上選定的是葉綠體rbcL和matK基因;真菌學(xué)家則以ITS作為真菌的首選條形碼[7]。在植物病毒方面,尚未有開展生物條形碼技術(shù)的研究,本試驗(yàn)以煙草花葉病毒屬病毒為研究對象,初步篩選評價(jià)適于該屬病毒檢測鑒定的生物條形碼。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    樣品:花葉癥狀明顯的西瓜、辣椒、南瓜、番茄、蕓豆、煙草及黃瓜等樣品采自山東省青島市田間,保存于-80 ℃冰箱,用作條形碼引物驗(yàn)證的樣本。

    試劑:RNApure超純總RNA快速提取試劑盒購自原平皓生物公司,Transcriptor cDNA Synth試劑盒購自羅氏公司,PCR master mix為MBI產(chǎn)品,DL2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)購自大連寶生物生物工程公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 條形碼引物設(shè)計(jì)

    以Genbank中煙草花葉病毒屬22個病毒的代表種作為病毒的憑證標(biāo)本(表1),分析其序列保守區(qū)域,根據(jù)條形碼引物設(shè)計(jì)的條件即擴(kuò)增片段長度、擴(kuò)增片段種內(nèi)的保守性和種間的變異性設(shè)計(jì)候選條形碼引物,具體引物信息見表2。

    1.3 總RNA提取與RT-PCR擴(kuò)增

    分別稱取樣品0.1 g,按照總RNA提取試劑盒步驟提取各樣品的總RNA。測定濃度后,以總RNA為模板,按照Transcriptor cDNA Synth試劑盒說明進(jìn)行第一鏈cDNA合成。以合成的cDNA為模板,分別使用上述引物,根據(jù)PCR master mix產(chǎn)品說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件見表2。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后送上海生工生物公司測序。

    1.4 測序及數(shù)據(jù)分析

    采用Omiga(version 2.0)軟件對測得序列進(jìn)行校對拼接;利用DNAMAN(version 4.0)軟件,采用Kimura-2-parameter distance (K2P)模型計(jì)算各序列的種內(nèi)和種間遺傳距離,評價(jià)各條形碼候選片段。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 條形碼引物通用性評價(jià)

    通過分析ICTV第九次報(bào)告中煙草花葉病毒屬確定種的代表序列,根據(jù)引物設(shè)計(jì)條件,設(shè)計(jì)6對候選條形碼引物。PCR擴(kuò)增效率是評價(jià)條形碼技術(shù)的重要標(biāo)準(zhǔn)。以提取的總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,驗(yàn)證6對引物的擴(kuò)增效率。Tobamo1的效率最低,在所有樣品中均無擴(kuò)增;Tobamo2、Tobamo3、Tobamo4和Tobamo5的效率次之,只在部分樣品中擴(kuò)增到預(yù)期大小的產(chǎn)物(電泳結(jié)果未顯示);Tobamo6的效率最高,為100%,在所有測試樣品中均擴(kuò)增出一條清晰的約200 bp的條帶(圖1)。

    PCR產(chǎn)物的測序成功率是評價(jià)條形碼引物的另一個重要標(biāo)準(zhǔn)。6對引物中,Tobamo4、Tobamo5和Tobamo6的測序成功率均為100%(表3)。綜合PCR擴(kuò)增效率和測序成功率,6對候選條形碼引物中以Tobamo6的效果最好,可將其作為煙草花葉屬病毒檢測鑒定的首選條形碼。

    2.2 條形碼引物物種分辨率評價(jià)

    將煙草花葉病毒屬憑證標(biāo)本序列和Tobamo6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列構(gòu)建鄰接樹,分析病毒種之間的親緣關(guān)系,確定條碼序列在病毒種類鑒定分類中的效果(圖2)。Tobamo6在辣椒和南瓜樣品中擴(kuò)增到的4個辣椒輕斑駁病毒分離物(PMMoV-SD1、 -SD3、-SD8、-SD9)與代表分離物-S聚為PMMoV簇;在西瓜中擴(kuò)增到的黃瓜綠斑駁花葉病毒分離物(CGMMV-SD)與其代表分離物-SH聚為CGMMV簇;在煙草和黃瓜上檢測到的3個煙草花葉病毒分離物(TMV-SD3、-SD4、-SD5)與其代表分離物聚為TMV簇;而番茄和蕓豆上的4個番茄花葉病毒分離物(ToMV-SD1、-SD2、-SD3、-SD4)聚為ToMV簇;同時(shí)這4個簇與其他病毒種都明顯區(qū)分開。上述結(jié)果表明,Tobamo6從表現(xiàn)病毒癥狀的不同樣品中獲得的同種病毒分離物的序列在種內(nèi)變異足夠小,可以通過聚類確認(rèn)為同一個病毒種;并且這些同種病毒分離物與不同病毒種的種間變異足夠大,能夠有效區(qū)分不同的病毒種;說明該對條碼引物在煙草花葉病毒屬中具有良好的物種分辨率。

    將測定序列在NCBI中進(jìn)行序列比對,結(jié)果顯示分別為辣椒輕斑駁病毒、黃瓜綠斑駁花葉病毒、煙草花葉病毒和番茄花葉病毒(表4),比對結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果一致,進(jìn)一步證明了Tobamo6具有良好的物種分辨率。

    3 小結(jié)與討論

    煙草花葉病毒屬病毒的寄主范圍非常廣,可侵染的植物達(dá)150多個屬,主要是一些草本雙子葉植物,包括蔬菜、花卉和煙草等,給這些作物的種植帶來嚴(yán)重危害。國內(nèi)不少學(xué)者分別針對不同的煙草花葉病毒屬病毒進(jìn)行檢測技術(shù)的研究,羅朝鵬[8]、郭京澤等[9]分別就煙草花葉病毒和辣椒輕斑駁病毒進(jìn)行了RT-PCR檢測技術(shù)探討。生物條形碼技術(shù)的研究可對煙草花葉病毒屬內(nèi)的所有病毒進(jìn)行有效的檢測鑒定,該技術(shù)的推廣應(yīng)用將極大提高口岸標(biāo)本檢測的效率和貨品的通關(guān)速度。

    通常在物種識別中長序列比短序列的識別率高,在關(guān)系密切的類群中,增加序列信息能夠增加解析度[10]。然而,當(dāng)樣本質(zhì)量不高,存在RNA降解情況時(shí),常常難以獲得完整的生物條形碼信息,相對而言,約200 bp的微型生物條形碼的序列更易于擴(kuò)增獲得。范京安等[11]以果實(shí)蠅物種鑒定的虛擬試驗(yàn)和實(shí)體試驗(yàn)表明,微型生物條形碼鑒定果實(shí)蠅物種的準(zhǔn)確性與生物條形碼基本一致,均可作為果實(shí)蠅物種鑒定的有效依據(jù)。本研究表明,約200 bp的候選片段Tobamo6的擴(kuò)增效率和測序成功率均明顯優(yōu)于其他長片段的條形碼,可考慮將其作為植物煙草花葉病毒屬病毒檢測的首選條形碼。由于試驗(yàn)材料的局限,還應(yīng)加大樣本量,進(jìn)一步檢驗(yàn)該條形碼在煙草花葉病毒屬其他病毒檢測中的適用性。endprint

    參考文獻(xiàn):

    [1] KING A M,LEFKOWITZ E,ADAMS M J,et al.Virus taxonomy: ninth report of the international committee on taxonomy of viruses[M]. Amsterdam:Elsevier/Academic Press,2011.

    [2] 侯紅琴,譚志瓊,張振臣.煙草花葉病毒屬研究新進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)第,2008,24(5):304-307.

    [3] 許清孝.煙草花葉病毒的檢測方法研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2013(11):128-132.

    [4] 錢 路,安榆林.物種鑒定的新武器-基因條碼[J].植物檢疫,2009(3):42-46.

    [5] HEBERT P D,CYWINSKA A,BALL S L,et al.Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings: Biological Sciences,2003,270(1512):313-321.

    [6] HEBERT P D,RATNASINGHAM S, DEWAARD J R. Barcoding animal life: cytochrome coxidase subunit 1 divergences among closely related species[J]. Proceedings: Biological Sciences,2003(270): 96-99.

    [7] 張 宇.真菌DNA條形碼研究進(jìn)展[J].菌物學(xué)報(bào),2012,31(6):809-820.

    [8] 羅朝鵬,楊 軍,金立峰,等.煙草花葉病毒病的分子鑒定[J].煙草科技,2010(7):58-61.

    [9] 郭京澤,劉 鵬,崔鐵軍,等.辣椒種子中辣椒輕斑駁病毒檢測[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué),2007,17(6):32-34.

    [10] 歐陽小艷,莫幫輝,余華麗,等.DNA條形碼識別-DNA條形碼與DNA芯片識別蚊媒準(zhǔn)確性的比較[J].中國國境衛(wèi)生檢疫雜志,2007,30(6):349-352.

    [11] 范京安,顧海豐,陳世界,等.DNA條形碼識別Ⅵ-基于微型DNA條形碼的果實(shí)蠅物種鑒定[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2009,15(2):215-219.endprint

    猜你喜歡
    鑒定
    非正常死亡案件死亡性質(zhì)的法醫(yī)學(xué)鑒定分析
    法制博覽(2016年12期)2016-12-28 18:55:48
    基于刑事訴訟法視域探討法醫(yī)DNA證據(jù)問題
    韓國引進(jìn)水稻品種的鑒定與利用評價(jià)
    無毛黃瓜同源四倍體誘導(dǎo)及鑒定
    論疑似精神病人的刑事責(zé)任能力
    試析檔案整理與鑒定
    古籍版本鑒定
    淺議檢察機(jī)關(guān)司法會計(jì)鑒定的主要職責(zé)
    青銅器鑒定與修復(fù)初探
    資治文摘(2016年7期)2016-11-23 00:23:20
    八種氟喹諾酮類藥物人工抗原的合成及鑒定
    美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国精品久久久久久国模美| 香蕉久久夜色| 午夜视频精品福利| 捣出白浆h1v1| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久久久久人人人人人| 高清视频免费观看一区二区| 久久性视频一级片| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美黑人精品巨大| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美精品啪啪一区二区三区| 午夜福利欧美成人| 久久久久久久久久久久大奶| 午夜成年电影在线免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 精品国产美女av久久久久小说| 人成视频在线观看免费观看| 日韩欧美在线二视频 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美一级毛片孕妇| 曰老女人黄片| 国产av一区二区精品久久| 男女下面插进去视频免费观看| 国产97色在线日韩免费| av不卡在线播放| 午夜免费成人在线视频| 91av网站免费观看| 人妻久久中文字幕网| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜福利欧美成人| 亚洲av熟女| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲精品自拍成人| 在线播放国产精品三级| 妹子高潮喷水视频| 男女床上黄色一级片免费看| 免费在线观看黄色视频的| 99精品在免费线老司机午夜| www.自偷自拍.com| 99国产综合亚洲精品| 极品人妻少妇av视频| 我的亚洲天堂| 不卡一级毛片| 国产成人精品在线电影| 少妇的丰满在线观看| 国产在视频线精品| av在线播放免费不卡| 人成视频在线观看免费观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲av成人av| 午夜老司机福利片| 久久 成人 亚洲| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 黑丝袜美女国产一区| 69精品国产乱码久久久| 日日爽夜夜爽网站| 日本五十路高清| 国产精品一区二区在线观看99| 无人区码免费观看不卡| 超碰成人久久| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产1区2区3区精品| 欧美 日韩 精品 国产| 在线永久观看黄色视频| 中国美女看黄片| 多毛熟女@视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 人妻一区二区av| 久久九九热精品免费| www.熟女人妻精品国产| 黄色 视频免费看| 捣出白浆h1v1| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美乱色亚洲激情| 两个人免费观看高清视频| 亚洲黑人精品在线| 99久久综合精品五月天人人| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 久久ye,这里只有精品| 久久香蕉精品热| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美乱妇无乱码| 脱女人内裤的视频| 午夜福利视频在线观看免费| 男女下面插进去视频免费观看| 国产精品欧美亚洲77777| 一二三四在线观看免费中文在| 丰满的人妻完整版| 午夜精品久久久久久毛片777| 一级毛片精品| 国产精品久久久av美女十八| 一级片免费观看大全| 久久久久精品国产欧美久久久| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲久久久国产精品| 久99久视频精品免费| 亚洲成人手机| 免费少妇av软件| 国产精品久久久久久人妻精品电影| www.熟女人妻精品国产| 男人舔女人的私密视频| 极品教师在线免费播放| 男女高潮啪啪啪动态图| 好男人电影高清在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 欧美黄色淫秽网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产精品.久久久| 国产成人精品久久二区二区91| 婷婷丁香在线五月| 又黄又粗又硬又大视频| 村上凉子中文字幕在线| 一级,二级,三级黄色视频| 最近最新中文字幕大全电影3 | 电影成人av| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 少妇粗大呻吟视频| 国产av精品麻豆| 婷婷丁香在线五月| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 黄频高清免费视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| videos熟女内射| 高清黄色对白视频在线免费看| 多毛熟女@视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 国产激情久久老熟女| 国产亚洲一区二区精品| 精品久久久久久久毛片微露脸| 91麻豆av在线| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久人妻熟女aⅴ| 精品欧美一区二区三区在线| 在线观看免费视频日本深夜| 五月开心婷婷网| 最新在线观看一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品久久久av美女十八| 黄片大片在线免费观看| 咕卡用的链子| 精品人妻在线不人妻| 这个男人来自地球电影免费观看| 91在线观看av| 国产91精品成人一区二区三区| 99香蕉大伊视频| 香蕉久久夜色| 天堂√8在线中文| 国产区一区二久久| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产精品av久久久久免费| 国产激情久久老熟女| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 久久久久久人人人人人| a级毛片在线看网站| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产xxxxx性猛交| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品永久免费网站| 精品人妻1区二区| cao死你这个sao货| 亚洲午夜理论影院| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产精品成人在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 夫妻午夜视频| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美日韩av久久| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产激情久久老熟女| 老司机靠b影院| 性色av乱码一区二区三区2| 国产人伦9x9x在线观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 欧美日韩成人在线一区二区| 热re99久久国产66热| 亚洲片人在线观看| bbb黄色大片| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 捣出白浆h1v1| 久久ye,这里只有精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲五月天丁香| 国产1区2区3区精品| 亚洲成人免费av在线播放| 性色av乱码一区二区三区2| 免费av中文字幕在线| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产亚洲欧美98| 国产亚洲一区二区精品| 91成年电影在线观看| 久久草成人影院| 999精品在线视频| 一个人免费在线观看的高清视频| av一本久久久久| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 777米奇影视久久| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品av久久久久免费| 国产片内射在线| 99久久人妻综合| 国产黄色免费在线视频| 成年人午夜在线观看视频| 91精品三级在线观看| 亚洲综合色网址| 少妇粗大呻吟视频| 中文欧美无线码| 女性被躁到高潮视频| 大香蕉久久网| 久久久久久久久免费视频了| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 久久婷婷成人综合色麻豆| 一夜夜www| 欧美最黄视频在线播放免费 | 在线免费观看的www视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产精品久久久久久精品古装| 18禁美女被吸乳视频| 欧美最黄视频在线播放免费 | 大香蕉久久网| 午夜免费鲁丝| 他把我摸到了高潮在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 欧美精品高潮呻吟av久久| av福利片在线| 国产99白浆流出| 精品福利永久在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 国产午夜精品久久久久久| 色综合欧美亚洲国产小说| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 91国产中文字幕| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产精品九九99| 国产精品永久免费网站| av欧美777| 美女 人体艺术 gogo| 国产视频一区二区在线看| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久青草综合色| 99re在线观看精品视频| 久久久国产成人精品二区 | av有码第一页| 看免费av毛片| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲欧美色中文字幕在线| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲五月天丁香| 不卡av一区二区三区| 久久久久久久午夜电影 | 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 老司机深夜福利视频在线观看| 黄色视频不卡| 免费观看精品视频网站| 午夜福利,免费看| 久久久国产一区二区| 午夜免费成人在线视频| 很黄的视频免费| 黄色 视频免费看| 99riav亚洲国产免费| 女性被躁到高潮视频| 黄色视频,在线免费观看| av国产精品久久久久影院| 午夜福利一区二区在线看| 久久久久视频综合| 涩涩av久久男人的天堂| x7x7x7水蜜桃| 国产深夜福利视频在线观看| 成年人黄色毛片网站| 欧美日韩精品网址| av网站免费在线观看视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲九九香蕉| 丝袜美足系列| 色94色欧美一区二区| 91老司机精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 黑人猛操日本美女一级片| 久久久久久人人人人人| 男女免费视频国产| 黑人操中国人逼视频| 亚洲熟妇熟女久久| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲成人国产一区在线观看| 久久人妻av系列| 国产av一区二区精品久久| 精品午夜福利视频在线观看一区| 欧美在线黄色| 久久久久国产一级毛片高清牌| 99久久人妻综合| 在线观看免费午夜福利视频| 久久影院123| 男女午夜视频在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 午夜视频精品福利| tocl精华| 婷婷成人精品国产| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 999精品在线视频| 青草久久国产| 热re99久久精品国产66热6| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 国产熟女午夜一区二区三区| 少妇粗大呻吟视频| 日本一区二区免费在线视频| 在线观看66精品国产| 久久99一区二区三区| 国产在视频线精品| 日本a在线网址| 国产免费男女视频| 黑丝袜美女国产一区| 色综合婷婷激情| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲 欧美一区二区三区| 99热只有精品国产| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 校园春色视频在线观看| 亚洲片人在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 一a级毛片在线观看| 中出人妻视频一区二区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 老司机福利观看| 搡老岳熟女国产| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产又爽黄色视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 一a级毛片在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 天天影视国产精品| 一级片'在线观看视频| 搡老岳熟女国产| 91麻豆av在线| 一区二区日韩欧美中文字幕| 在线播放国产精品三级| 99热只有精品国产| 日日夜夜操网爽| 捣出白浆h1v1| 热re99久久国产66热| 90打野战视频偷拍视频| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲七黄色美女视频| 不卡av一区二区三区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲黑人精品在线| 国产视频一区二区在线看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲五月色婷婷综合| 嫁个100分男人电影在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 超色免费av| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美精品一区二区免费开放| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产区一区二久久| 国产淫语在线视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产不卡av网站在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲久久久国产精品| 精品国内亚洲2022精品成人 | 黑人欧美特级aaaaaa片| 啦啦啦 在线观看视频| 久久 成人 亚洲| 亚洲人成77777在线视频| 9191精品国产免费久久| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 老司机深夜福利视频在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 午夜激情av网站| 麻豆av在线久日| 日本黄色视频三级网站网址 | av天堂在线播放| 国产成人免费观看mmmm| 精品视频人人做人人爽| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美激情极品国产一区二区三区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 黄频高清免费视频| 国产精品免费视频内射| 波多野结衣一区麻豆| 大型黄色视频在线免费观看| 在线av久久热| 久热这里只有精品99| 黄色丝袜av网址大全| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲在线自拍视频| 久久久国产精品麻豆| av电影中文网址| 国产成人精品久久二区二区91| 一级a爱视频在线免费观看| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲欧美激情综合另类| 国产不卡一卡二| 亚洲精品国产色婷婷电影| 一进一出好大好爽视频| 欧美最黄视频在线播放免费 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 999久久久精品免费观看国产| 99热国产这里只有精品6| 久久精品国产a三级三级三级| 国产单亲对白刺激| 久久天堂一区二区三区四区| 国产激情欧美一区二区| 欧美日韩乱码在线| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 制服诱惑二区| videos熟女内射| 国产激情久久老熟女| 亚洲av美国av| 精品高清国产在线一区| 日本a在线网址| 亚洲精品成人av观看孕妇| 黄片大片在线免费观看| 国产深夜福利视频在线观看| 久久久国产一区二区| 久久中文看片网| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲一码二码三码区别大吗| 午夜两性在线视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| tube8黄色片| 日韩欧美在线二视频 | 成人永久免费在线观看视频| 麻豆av在线久日| 黄色 视频免费看| 两人在一起打扑克的视频| 国产真人三级小视频在线观看| av天堂久久9| 五月开心婷婷网| 99国产精品一区二区三区| 免费看十八禁软件| 男人舔女人的私密视频| 成人三级做爰电影| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久 成人 亚洲| 日韩欧美免费精品| 少妇 在线观看| 成人黄色视频免费在线看| av中文乱码字幕在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产成人精品久久二区二区91| 日本黄色视频三级网站网址 | 两个人免费观看高清视频| 一级毛片女人18水好多| 欧美激情高清一区二区三区| 一级a爱视频在线免费观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品久久久久久,| www.熟女人妻精品国产| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 日韩人妻精品一区2区三区| 美女视频免费永久观看网站| 女人被狂操c到高潮| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产高清视频在线播放一区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产精品免费一区二区三区在线 | 日本精品一区二区三区蜜桃| 91在线观看av| 这个男人来自地球电影免费观看| 好男人电影高清在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 大香蕉久久成人网| av线在线观看网站| 亚洲综合色网址| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 高清在线国产一区| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久香蕉国产精品| 真人做人爱边吃奶动态| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲av成人一区二区三| 露出奶头的视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久热这里只有精品99| 国产高清国产精品国产三级| 久久天堂一区二区三区四区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜福利,免费看| 欧美最黄视频在线播放免费 | 美女午夜性视频免费| 婷婷丁香在线五月| 国产高清激情床上av| 国产精品一区二区在线不卡| 在线天堂中文资源库| 中文字幕高清在线视频| 极品教师在线免费播放| 欧美国产精品va在线观看不卡| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 午夜两性在线视频| 在线观看日韩欧美| www.自偷自拍.com| 欧美黄色淫秽网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 正在播放国产对白刺激| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 女性被躁到高潮视频| 又大又爽又粗| 久久久精品区二区三区| 一进一出抽搐动态| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 在线看a的网站| 亚洲五月色婷婷综合| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 午夜免费成人在线视频| 99热网站在线观看| 91成人精品电影| 婷婷丁香在线五月| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 最新的欧美精品一区二区| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲欧美激情综合另类| 一a级毛片在线观看| 久久影院123| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 激情视频va一区二区三区| 免费在线观看黄色视频的| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产1区2区3区精品| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲五月色婷婷综合| 视频区图区小说| 亚洲欧美色中文字幕在线| 高清在线国产一区| 大香蕉久久网| av电影中文网址| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲精品在线美女| 视频区图区小说| 精品一区二区三卡| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产欧美亚洲国产| 国产亚洲精品一区二区www | 热99国产精品久久久久久7| 精品福利永久在线观看| 久久久精品区二区三区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产又色又爽无遮挡免费看| 成人18禁在线播放| 欧美日本中文国产一区发布| 怎么达到女性高潮| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 麻豆av在线久日| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 国产高清videossex| 99在线人妻在线中文字幕 | 日韩欧美免费精品| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产精品偷伦视频观看了| 丝瓜视频免费看黄片| 色综合欧美亚洲国产小说| 午夜福利,免费看| 亚洲av成人一区二区三| 人成视频在线观看免费观看| 超碰97精品在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 老司机影院毛片| 国产精品98久久久久久宅男小说|