雙水相萃取—高效液相色譜法檢測高效氯氰菊酯及其降解產(chǎn)物

王博文　唐愛星　韋瀅軍等

摘要：通過Plackett-Burman試驗，建立一種乙腈-無機鹽-水雙水相萃取-高效液相色譜法檢測高效氯氰菊酯及其降解產(chǎn)物3-苯氧基苯甲醛與3-苯氧基苯甲酸，確立雙水相萃取體系的最佳條件為：V乙腈 ∶V樣品溶液=1 ∶1，振蕩時間3 min，氯化鈉 ∶樣品溶液=1 g ∶1 mL。在最佳萃取條件下，對生物降解體系中濃度分別為10、100 mg/L的底物和降解產(chǎn)物平均回收率為94.6%～98.3%，變異系數(shù)為2.1%～3.4%。該方法可以同時檢測生物降解過程中高效氯氰菊酯及其降解產(chǎn)物3-苯氧基苯甲醛與3-苯氧基苯甲酸，操作簡單，結(jié)果準確。

關(guān)鍵詞：雙水相萃??；高效液相色譜法；高效氯氰菊酯；3-苯氧基苯甲酸；3-苯氧基苯甲醛

中圖分類號： O657.7+2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0268-03

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一種廣譜、高效的殺蟲劑，由于其廣泛使用而導致環(huán)境中存在大量殘留[1-2] 。研究表明，擬除蟲菊酯殘留會危害哺乳動物和人類的健康，具有潛在的致癌性、生殖毒性、神經(jīng)毒性以及引發(fā)急性中毒[3-5]。同時，高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯等多種擬除蟲菊酯的降解中間產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸也具有生殖毒性，在土壤中遷移性比母體化合物更強，對環(huán)境更具危害。

生物修復在降解和消除農(nóng)藥殘留方面具有安全、高效等特點，是治理農(nóng)藥環(huán)境污染的有效途徑。利用微生物及其產(chǎn)生的降解酶來消除農(nóng)藥污染已成為目前研究的熱點，而對降解體系中農(nóng)藥及其降解產(chǎn)物的檢測是此類研究的基礎。目前，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥常用的檢測方法為有機溶劑萃取-氣相色譜或者高效液相色譜法。氣相色譜法具有靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點，但是不能對不易氣化或受熱易分解的農(nóng)藥進行檢測，對3-苯氧基苯甲酸等酸性降解產(chǎn)物的檢測通常需要衍生化。高效液相色譜法可以檢測分子量較大、極性強與離子型的農(nóng)藥，具有檢測效率高、靈敏度高、速度快和操作自動化程度高等優(yōu)點，是農(nóng)藥殘留分析的重要方法。通常農(nóng)藥萃取采用乙酸乙酯、環(huán)己烷等為萃取劑的液液萃取法，雖然這些溶劑對殘留農(nóng)藥及降解產(chǎn)物有較好的溶解性，萃取回收率高，但采用高效液相色譜法檢測時往往會出現(xiàn)溶劑峰的干擾，需要氮吹或其他凈化處理，操作復雜，增大了試驗誤差。

雙水相萃取法（aqueous two-phase extraction）是根據(jù)親水性高分子聚合物或有機溶劑與無機鹽在水溶液中超過一定濃度后可以形成兩相，利用目標物在兩相溶液中分配系數(shù)不同而進行分離的方法[6]，具有條件溫和、價廉、溶劑消耗較少等優(yōu)點，在生物物質(zhì)萃取及金屬離子分離測定中得到廣泛應用[7]，如賈風燕等使用雙水相萃取-高效液相色譜法檢測魚肉樣品中6種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，回收率為81.1%～964%[8]。乙腈是高效液相色譜常用的流動相，采用乙腈-無機鹽水雙水相萃取，可以避免高效液相色譜檢測中溶劑峰對擬除蟲菊酯及其降解產(chǎn)物峰的干擾，簡化凈化步驟，有利于檢測分析。目前，有關(guān)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的雙水相萃取的報道還比較少。本研究通過建立一種乙腈-無機鹽-水雙水相萃取體系用于高效氯氰菊酯生物降解體系中底物及代謝產(chǎn)物的檢測，以期對其他擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測具有借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa） GF31，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 （CGMCC）保藏，登記入冊編號 CGMCC No.7173；95.8%高效氯氰菊酯標準品，由廣西田園生物有限公司提供；97.0% 3-苯氧基苯甲醛與99.0% 3-苯氧基苯甲酸分別購于J&K chemical LTD與Acros Organics；乙腈色譜純，購于Fisher公司；其他常用藥品，購于西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

ULTIMATE 3000高效液相色譜儀，配有紫外檢測器，美國熱電集團生產(chǎn)；LDZ4-1.2離心機，北京眾益中和生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；EP214C分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn)；H-1微型漩渦混合器，上海精科實業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.3 溶液配制與胞外酶制備

20 g/L高效氯氰菊酯貯備液的制備：準確稱取 0205 8 g 高效氯氰菊酯原藥，精確至0.2 mg，用乙腈定容至10 mL；2 g/L 3-苯氧基苯甲酸貯備液的制備：準確稱取0020 2 g 3-苯氧基苯甲酸原藥，精確至0.2 mg，用乙腈定容至10 mL；2 g/L 3-苯氧基苯甲醛貯備液的制備：準確稱取0.020 6 g 3-苯氧基苯甲醛原藥，精確至 0.2 mg，用乙腈定容至10 mL；0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液的制備：稱取Na2HPO4·12H2O 7.169 g、KH2PO4 2.72 g，用蒸餾水溶解并定容至1 L，pH值調(diào)節(jié)至7.0；無機鹽培養(yǎng)基（MS）：MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO4 0.5 g、Na2HPO4·12H2O 1.0 g，蒸餾水溶解并定容至1 L，pH值調(diào)至7.0；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 5.0 g、NaCl 5.0 g，使用蒸餾水溶解并定容至1 L，pH值調(diào)節(jié)至7.0。培養(yǎng)基在121 ℃條件下滅菌 20 min。胞外粗酶液的制備：將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基裝于 250 mL 錐形瓶中，每瓶裝液量為30 mL，120 ℃滅菌30 min；接入菌種，在30 ℃、120 r/min 搖床中培養(yǎng)18 h；將發(fā)酵培養(yǎng)液用低溫冷凍離心機在4 ℃、6 000 r/min離心15 min；取上層清液，經(jīng)045 μm濾膜過濾，再用Milipore 10 kDa超濾膜超濾獲得超濾截留液，即為胞外粗酶液。

1.4 雙水相萃取方法

將高效氯氰菊酯貯備液用無機鹽培養(yǎng)基（MS）稀釋為 50 mg/L；取1 mL溶液，加入0.1 mL 1 mol/L鹽酸酸化；加入一定量乙腈，渦旋振蕩一定時間，再加入一定量的NaCl振蕩，以3 000 r/min離心10 min，取上層液，通過0.22 μm有機相膜過濾后進行高效液相色譜分析。高效氯氰菊酯回收率（Recovery rate，R） 計算公式為：R=ACu/C0，其中，A為稀釋倍數(shù)，Cu為上相溶液中高效氯氰菊酯的量，C0為初始加入的高效氯氰菊酯的量。3-苯氧基苯甲醛與3-苯氧基苯甲酸雙水相萃取方法及回收率計算方法同上。endprint

1.5 降解體系中高效氯氰菊酯及其降解產(chǎn)物檢測

將菌體GF31接種于含有50 mg/L高效氯氰菊酯的無機鹽培養(yǎng)基中，一定條件下降解3 d，取樣經(jīng)雙水相萃取后進行高效液相色譜法檢測。將胞外酶加入到含有50 mg/L高效氯氰菊酯的磷酸鹽緩沖溶液中，一定條件下降解48 h，取樣經(jīng)雙水相萃取后進行高效液相色譜法檢測。

1.6 高效液相色譜檢測

檢測條件：色譜柱AQUASIL C18（4.6×250 mm×5 μm）柱，紫外檢測器波長為235 nm，流動相為乙腈 ∶水=85 ∶15（體積比，下同），流速為1 mL/min，溫度30 ℃，進樣量20 μL，采用自動進樣器控制。采用外標法定量，高效氯氰菊酯標準曲線回歸方程為y=0.678x+0.489，r2=0.999 7，其中，y為高效氯氰菊酯總峰面積，mAU/min，x為高效氯氰菊酯進樣濃度，mg/L。3-苯氧基苯甲酸標準曲線回歸方程為y=1.121x-0.169，r2=0.999 5，其中，y為3-苯氧基苯甲酸峰面積，mAU/min；x為3-苯氧基苯甲酸進樣濃度，mg/L。3-苯氧基苯甲醛標準曲線回歸方程為y=2.514x-0.137，r2=0999 3，其中，y為3-苯氧基苯甲醛峰面積，mAU/min；x為3-苯氧基苯甲醛進樣濃度，mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相萃取優(yōu)化試驗方案設計

試驗選取可能影響高效氯氰菊酯萃取的3個因素進行Plackett-Burman試驗，3個因素分別為乙腈（A）、振蕩時間（B）和氯化鈉量（C），每個因素選取高水平1和低水平-1（表1），以高效氯氰菊酯回收率為響應值（表2），利用Minitable軟件對試驗結(jié)果進行分析，得出各因素的t值和可信度水平。由表3、圖1、圖2可見，乙腈加入量對萃取有顯著影響，乙腈加入量越少，萃取回收率越高，當乙腈 ∶樣品溶液=1 ∶1時，高效氯氰菊酯回收率最高，達到98.0%；當乙腈 ∶樣品溶液=5 ∶1時，回收率僅為84.4%。其他2個因素對試驗沒有顯著影響。因此，采用乙腈 ∶樣品溶液=1 ∶1、振蕩時間3 min、氯化鈉 ∶樣品溶液=1 g ∶1 mL為乙腈-氯化鈉-水雙水相萃取高效氯氰菊酯的最優(yōu)條件。

2.2 回收率的測定

高效氯氰菊酯生物降解體系分別為菌體降解體系與酶降解體系，菌體降解在無機鹽培養(yǎng)基中進行，酶降解在磷酸緩沖溶液中進行，分別考察無機鹽培養(yǎng)基和磷酸緩沖溶液中高效氯氰菊酯及其降解產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸和3-苯氧基苯甲醛的雙水相萃取法效果。由表4可見，對10、100 mg/L高效氯氰菊酯、3-苯氧基苯甲酸和3-苯氧基苯甲醛的平均回收率為94.6%～98.3%、變異系數(shù)為2.1%～3.4%。有文獻報道，平均回收率為90%～96%、變異系數(shù)為1.1%～39%，即認為檢測方法比較精確[9]。因此，本試驗方法可精確定量測定高效氯氰菊酯、3-苯氧基苯甲酸和3-苯氧基苯甲醛。

2.3 降解體系中高效氯氰菊酯及其降解產(chǎn)物的檢測

由圖3可見，高效氯氰菊酯、3-苯氧基苯甲酸和3-苯氧基苯甲醛標準品在12 min內(nèi)可以實現(xiàn)完全分離，符合分析要求。根據(jù)標準曲線，在實際酶降解體系中，可以同時定量檢測底物高效氯氰菊酯與其降解產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸與3-苯氧基苯甲醛（圖4）。同理， 菌降解體系中各物質(zhì)也可以定量檢測（圖5），但是僅檢測到3-苯氧基苯甲酸，未檢測到3-苯氧基苯甲醛，這可能是因為降解產(chǎn)生的3-苯氧基苯甲醛被菌體迅速轉(zhuǎn)化為3-苯氧基苯甲酸。Tallur等發(fā)現(xiàn)，微球菌（Micrococcus sp.）CPN 1可以把3-苯氧基苯甲醛轉(zhuǎn)化為3-苯氧基苯甲酸[10]，這與本試驗結(jié)論一致。

3 結(jié)論

微生物降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有速度快、操作簡單、減少二次污染、成本低廉等優(yōu)點，具有良好的發(fā)展前景，目前已有較多關(guān)于微生物降解擬除蟲菊酯的報道。3-苯氧基苯甲酸與3-苯氧基苯甲醛是高效氯氰菊酯、甲氰菊酯等多種擬除蟲菊酯的主要代謝產(chǎn)物，是研究此類農(nóng)藥降解進程及降解機理的重要標的物。目前，研究者采用不同方法分別檢測擬除蟲菊酯和其降解產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸與3-苯氧基苯甲醛[11-12]，操作復雜，費時費力。

本研究建立了一種乙腈-無機鹽-水雙水相萃取系統(tǒng)，用于高效液相色譜法檢測生物降解體系樣品中高效氯氰菊酯及其降解產(chǎn)物，具有萃取與凈化的優(yōu)點，操作簡便，結(jié)果準確，能同時檢測氯氰菊酯生物降解體系中底物與降解產(chǎn)物，這為其他擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和環(huán)境污染物的檢測提供了借鑒。

參考文獻：

[1]Mehler W T，Li H Z，Lydy M J，et al. Identifying the causes of sediment-associated toxicity in urban waterways of the Pearl River Delta，China[J]. Environmental Science & Technology，2011，45（5）：1812-1819.

[2]Li H Z，Mehler W T，Lydy M J，et al. Occurrence and distribution of sediment-associated insecticides in urban waterways in the Pearl River Delta，China[J]. Chemosphere，2011，82（10）：1373-1379.

[3]Shafer T J，Meyer D A，Crofton K M. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides：critical review and future research needs[J]. Environmental Health Perspectives，2005，113（2）：123-136.endprint

[4]Garey J，Wolff M S. Estrogenic and antiprogestagenic activities of pyrethroid insecticides[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1998，251（3）：855-859.

[5]Wijngaarden R P A V，Brock T C M，Brink P J V D. Threshold levels for effects of insecticides in freshwater ecosystems：a review[J]. Ecotoxicology，2005，14（3）：355-380.

[6]謝 海. 雙水相萃取技術(shù)研究現(xiàn)狀[J]. 化學工業(yè)與工程，2006，23（5）：463-466.[HJ1.7mm]

[7]鄧凡政，魏 迎，陳 影，等. 雙水相體系中Cu（Ⅱ），La（Ⅲ），U（Ⅵ），Ce（Ⅳ）光譜行為及萃取分離[J]. 光譜學與光譜分析，2004，24（12）：1637-1639.

[8]賈風燕，王文文，劉振波，等. 乙腈-無機鹽-水雙水相體系萃取-氣相色譜法檢測魚肉中擬除蟲菊酯[J]. 化學學報，2012，70（4）：485-491.

[9]劉 新，尤民生，廖金英，等. 甲胺磷降解菌的分離與降解效能測定[J]. 武夷科學，2001，17（1）：51-55.

[10]Tallur P N，Megadi V B，Ninnekar H Z，et al. Biodegradation of cypermethrin by Micrococcus sp. strain CPN 1[J]. Biodegradation，2008，19（1）：77-82.

[11]Wang B Z，Ma Y，Zhou W，et al. Biodegradation of synthetic pyrethroids by Ochrobactrum tritici strain pyd-1[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2011，27（10）：2315-2324.

[12]Chen S H，Hu Q B，Hu M Y，et al. Isolation and characterization of a fungus able to degrade pyrethroids and 3-phenoxybenzaldehyde[J]. Bioresource Technology，2011，102（17）：8110-8116.endprint