5-羥色胺及其受體亞型在慢性前列腺炎大鼠脊髓的差異性表達(dá)

張述蓉，趙秀娟，李 露，徐 晨,2*

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1.生命科學(xué)研究院； 2.電子顯微鏡室， 重慶 400016)

?

5-羥色胺及其受體亞型在慢性前列腺炎大鼠脊髓的差異性表達(dá)

張述蓉1，趙秀娟1，李 露1，徐 晨1,2*

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1.生命科學(xué)研究院； 2.電子顯微鏡室， 重慶 400016)

目的研究5-HT和5-HT2A、5-HT2C、5-HT5A和5-HTR7受體(5-HTR2A、5-HTR2C、5-HTR5A和5-HTR7)在慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征(CP/CPPS)大鼠T13～S1脊髓節(jié)段的差異性表達(dá)。方法將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、45 d、60 d和90 d模型組，用自身免疫法構(gòu)建CP/CPPS模型。用免疫組織化學(xué)及RT-PCR法檢測(cè)脊髓T13～L2、L3～L4和L5～S1節(jié)段5-HT及各受體的表達(dá)。結(jié)果CP/CPPS大鼠自發(fā)性疼痛行為學(xué)評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。5-HT在各模型組大鼠脊髓3個(gè)節(jié)段表達(dá)均下降。在T13～L2節(jié)段, 5-HTR2A、5-HTR5A的表達(dá)持續(xù)上調(diào)(P<0.05)，5-HT2C、5-HTR7先升高后下降(P<0.05)；在L3～L4節(jié)段各受體表達(dá)均先升高后下降(P<0.05)；在L5～S1節(jié)段，5-HT2C、5-HTR5A的表達(dá)持續(xù)上調(diào)(P<0.05)，5-HTR2A、5-HTR7先升高后下降(P<0.05)。結(jié)論5-HT及5-HTR2A、5-HTR2C、5-HTR5A和5-HTR7在不同時(shí)程CP/CPPS大鼠脊髓出現(xiàn)差異性表達(dá)，提示5-HT及其受體參與了CP/CPPS的中樞調(diào)控，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

5-羥色胺；5-羥色胺受體；慢性前列腺炎；脊髓；大鼠

慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征(chronic prostatitis /chronic pelvic pain syndrome，CP/CPPS)是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的疾病之一，在男性中的發(fā)病率為9%～16%[1]。CP/CPPS臨床表現(xiàn)多樣，主要包括下尿路癥狀、疼痛，并常伴有神經(jīng)精神癥狀等。目前CP/CPPS的發(fā)病機(jī)制尚不明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為可能是感染、免疫失調(diào)、神經(jīng)性疼痛和盆底肌肉痙攣等多種致病機(jī)制共同作用的結(jié)果[2]。5-HT(serotonin)作為神經(jīng)遞質(zhì)和血管活性物質(zhì)，廣泛分布在周圍組織和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。近年來(lái)關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)5-HT對(duì)排尿反射、抑郁和疼痛的調(diào)節(jié)方面的研究取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，認(rèn)為5-HT可能參與了上述過(guò)程的調(diào)控[3]。研究表明5-HT2A、5-HT5A和5-HT7受體在大鼠脊髓支配盆底肌群的Onuf’s核有特異性表達(dá)[4- 5]。有關(guān)5-HT受體在CP/CPPS的差異性表達(dá)情況未見(jiàn)研究報(bào)道，本研究旨在研究5-HT及5-HTR2A、5-HTR2C、5-HTR5A和5-HTR7在CP/CPPS大鼠脊髓的差異性表達(dá)，為進(jìn)一步探討其在CP/CPPS發(fā)病機(jī)制中的作用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

SPF級(jí)雄性SD大鼠[重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(渝)20070001]。百白破疫苗(武漢生物制品研究所，批號(hào)：20080620- 5)。完全弗氏佐劑(Sigma公司)。兔抗鼠5-HT抗體(Immunostar公司)。生物素化羊抗兔IgG、ABC復(fù)合物、 DAB顯色劑(北京中杉金橋公司)。RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(TakaRa公司)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 模型制備

大鼠CP/CPPS造模方法按參考文獻(xiàn)[6]操作。

1.3 自發(fā)性疼痛行為學(xué)檢測(cè)

自發(fā)疼痛行為觀察指標(biāo)及評(píng)分參照參考文獻(xiàn)[7]。

1.4 免疫組織化學(xué)

取灌流固定的脊髓各節(jié)段，振動(dòng)切片機(jī)切片，片厚50 μm。1∶2 000稀釋的5-HT抗體于4 ℃孵育24 h后，37 ℃孵育1∶500稀釋的生物素化羊抗兔IgG 120 min；最后37 ℃孵育ABC復(fù)合物90 min，DAB顯色劑顯色。用Olympus CX31RBSF采集圖像，北航醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)量平均吸光度值。

1.5 RT-PCR

用RNA提取試劑盒提取總RNA，對(duì)OD260/D280值在1.8～2.1之間者反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取cDNA,用PTC- 100 PCR儀進(jìn)行熱循環(huán)。以上所有操作均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描成像系統(tǒng)對(duì)條帶吸光度進(jìn)行分析，用Labworks軟件計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

5-HT受體各亞型及GAPDH引物序列均由上海生工生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1 自發(fā)性疼痛行為學(xué)評(píng)分

各模型組大鼠疼痛行為評(píng)分均較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)(表2)。

2.2 5-HT在各脊髓節(jié)段的表達(dá)

T13～L2節(jié)段脊髓背角的5-HT平均吸光度值隨造模時(shí)程逐漸降低，60 d組和90 d組脊髓背角的5-HT平均吸光度值較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。L3～L4節(jié)段在45 d及90 d 組脊髓背角5-HT平均吸光度值較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。L5～S1節(jié)節(jié)段在90 d組大鼠脊髓背角5-HT平均吸光度值較對(duì)照組顯著降低(P<0.05) (圖1，表3)。

表2 自發(fā)性疼痛行為學(xué)評(píng)分

*P<0.05 compared with control group.

圖1 脊髓5-HT免疫組化結(jié)果Fig 1 The expression of 5-HT in spinal by immunohistochemisty(×100)

表3 各脊髓節(jié)段后角5-HT平均吸光度值

*P<0.05 compared with control group.

2.3 各受體亞型在脊髓節(jié)段的表達(dá)

各組大鼠脊髓3個(gè)脊髓節(jié)段均檢測(cè)5-HT受體亞型mRNA 的表達(dá) (圖2)。各模型組5-HTR2A在T13～L2、L3～L4節(jié)段的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，呈先升高后下降，但在L5～S1節(jié)段后期出現(xiàn)顯著的下調(diào)(P<0.05)； 5-HTR2C在各模型組T13～L2、L5～S1節(jié)段的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，在L5～S1節(jié)段持續(xù)升高，而在L3～L4節(jié)段呈先升高后降低；5-HTR5A在T13～L2、L5～S1節(jié)段表達(dá)量持續(xù)上調(diào)，且各模型組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，在L3～L4節(jié)段45 d組急劇升高后回落至接近正常水平；各模型組5-HTR7在3個(gè)脊髓節(jié)段的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，呈先升高后下降 (圖3)。

圖2 RT-PCR法檢測(cè)各脊髓節(jié)段5-HT受體亞型表達(dá)的電泳結(jié)果

*P<0.05 compared with control group圖3 5-HT受體亞型mRNA在3個(gè)脊髓節(jié)段各組的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

疼痛是CP/CPPS的主要癥狀。有學(xué)者認(rèn)為慢性前列腺炎疼痛是在前列腺受到刺激后通過(guò)脊髓反射引起的一種盆底、會(huì)陰肌肉的反射性痙攣性疼痛，研究發(fā)現(xiàn)5-HTR2A、5-HTR5A和5-HTR7除廣泛分布于脊髓背角以外，還分布于大鼠脊髓Onuf’s核內(nèi)不同的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，其中5-HTR2A主要分布于支配盆底坐骨海綿體肌的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，而5-HTR5A和5-HTR7受體主要分布于支配尿道外括約肌的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元[4- 5]。本研究采用自身免疫法構(gòu)建CP/CPPS大鼠模型，選取支配前列腺的相應(yīng)脊髓節(jié)段T13～L2、L3～L4和L5～S1[8- 9]研究5-HT及5-HTR2A、5-HTR2C、5-HTR5A和5-HTR7的表達(dá)情況。

研究結(jié)果表明，無(wú)論是對(duì)照組還是模型組各5-HT受體亞型在不同脊髓節(jié)段的表達(dá)均存在差異，這提示5-HT在不同脊髓節(jié)段可能參與不同生理功能調(diào)節(jié)。不同時(shí)程模型組大鼠自發(fā)性疼痛行為學(xué)評(píng)分均顯著高于對(duì)照組，同時(shí)5-HT各受體亞型在CP/CPPS大鼠3個(gè)脊髓節(jié)段的表達(dá)幾乎都升高，提示5-HTR2A、5-HTR2C、5-HTR5A、5-HTR7在脊髓Onuf’s核的高表達(dá)可能通過(guò)影響盆底肌群參與了CP/CPPS疼痛形成，這與已報(bào)道的5-HTR2A、5-HTR5A、5-HTR7在炎性反應(yīng)或神經(jīng)病理性疼痛模型脊髓水平表達(dá)上調(diào)的結(jié)果是一致的[10- 11]。近年來(lái)的研究表明，在脊髓水平5-HT2C、5-HTR5A和5-HTR7主要參與疼痛抑制作用，而5-HTR2A主要參與疼痛的易化作用[11- 12]，但鞘內(nèi)注射5-HT受體激動(dòng)劑α-甲基- 5羥色胺和DOI可以劑量依賴性地抑制SNL神經(jīng)病理性疼痛模型的機(jī)械痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏[13]，這提示5-HTR2A可能參與鎮(zhèn)痛。在本實(shí)驗(yàn)中，5-HTR2A在L3～L4、L5～S1節(jié)段的表達(dá)分別在45 d、60 d達(dá)到高峰后出現(xiàn)下調(diào)，變化趨勢(shì)與疼痛評(píng)分變化一致，因此認(rèn)為5-HTR2A在脊髓水平主要參與致痛。5-HTR2C、5-HTR5A的表達(dá)在90 d模型組自發(fā)性疼痛行為減少的情況下繼續(xù)上調(diào)，這提示在CP/CPPS后期由于參與鎮(zhèn)痛效應(yīng)的5-HTR2C、5-HTR5A持續(xù)上調(diào)，使5-HT在脊髓水平主要發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，使自發(fā)性疼痛行為評(píng)分下降。5-HTR7在模型組動(dòng)物45 d開(kāi)始升高，在造模60 d達(dá)到高峰，而在90 d時(shí)其表達(dá)量有所回落但仍顯著高于對(duì)照組，這提示5-HTR7可能在疼痛的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮著重要的作用。對(duì)5-HT的研究發(fā)現(xiàn)，所有模型組大鼠各脊髓節(jié)段5-HT表達(dá)較對(duì)照組均下降，這與來(lái)自神經(jīng)病理性疼痛研究中脊髓5-HT表達(dá)增高[14]的結(jié)果并不一致，造成這種差異的原因可能有：本研究采用CP/CPPS模型，主要表現(xiàn)為慢性疼痛，區(qū)別于一般疼痛研究所采用的急性疼痛模型；同時(shí)該模型還存在抑郁表現(xiàn)[15]及排尿功能障礙[6]，而已知5-HT同時(shí)參與上述這些過(guò)程，因此在CP/CPPS模型中5-HT的變化更加復(fù)雜。另一方面，5-HT受體表達(dá)升高也可負(fù)反饋調(diào)節(jié)引起5-HT遞質(zhì)釋放減少。

綜上所述，在大鼠CP/CPPS模型的不同時(shí)期5-HT及5-HTR1A、5-HTR2A、5-HTR2C、5-HTR5A、5-HTR7在脊髓T13-S1各節(jié)段出現(xiàn)差異性表達(dá)，提示5-HT及其受體參與了CP/CPPS疼痛癥狀的中樞形成機(jī)制，值得進(jìn)一步深入研究。

[1] Mahal BA, Cohen JM, Allsop SA,etal. The role of phenotyping in chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome[J]. Current Urol Rep，2011，124:297- 303.

[2] Strauss AC, Dimitrakov JD. New treatments for chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome[J]. Nat Rev Urol，2010，73:127- 135.

[3] Thor KB, Kirby M, Viktrup L. Serotonin and noradrenaline involvement in urinary incontinence, depression and pain: scientific basis for overlapping clinical efficacy from a single drug, duloxetine[J]. Int J Clin Pract，2007，618:1349- 1355.

[4] Xu C, Giuliano F, Sun XQ，etal. Serotonin 5-HT2A and 5-HT5A receptors are expressed by different motoneuron populations in rat Onuf’s nucleus[J]. J Comp Neurol，2007，502:620- 634.

[5] Zeng FQ，Xu C, Xu G. Distribution of serotonin 5-HT2A and 5-HT7 receptors in the Onuf’s nucleus of the rat spinal cord[J]. Neural Regen Res，2008，3:853- 857.

[6] 郝麗亞, 趙秀娟, 李露, 等. 免疫性慢性非細(xì)菌性前列腺炎大鼠的尿動(dòng)力學(xué)研究[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，37:758- 762.

[7] Wantuch C, Piesla M, Leventhal L. Pharmacological validation of a model of cystitis pain in the mouse[J]. Neurosci Lett，2007，421:250- 252.

[8] Krieger JN, Ross SO, Riley DE. Chronic prostatitis: epidemiology and role of infection[J]. Urology，2002，60:8- 12,13.

[9] Ishigooka M, Nakada T, Hashimoto T,etal. Spinal substance P immunoreactivity is enhanced by acute chemical stimulation of the rat prostate[J]. Urology，2002，59:139- 144.

[10] 劉翔宇, 武勝昔, 王亞云, 等. 福爾馬林致痛大鼠背根節(jié)內(nèi)5-HT受體亞型mRNA的表達(dá)變化[J]. 中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2006，12:28- 31.

[11] Munoz-Islas E, Vidal-Cantu GC, Bravo-Hernandez M，etal. Spinal 5-HT(5)A receptors mediate 5-HT-induced antinociception in several pain models in rats[J]. Pharmacol Biochem Behav, 2014, 120:25- 32.

[12] Bardin L. The complex role of serotonin and 5-HT receptors in chronic pain[J]. Behav Pharmacol, 2011, 22:390- 404.

[13] Obata H, Saito S, Sasaki M，etal. Antiallodynic effect of intrathecally administered 5-HT(2) agonists in rats with nerve ligation[J]. Pain, 2001, 90:173- 179.

[14] 劉希江, 曹菲, 卜慧蓮, 等. 紫杉醇誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角5-羥色胺含量變化[J]. 臨床麻醉學(xué)雜志, 2012, 28:262- 264.

[15] 李露, 郝麗亞, 李兆飛, 等. 艾司西酞普蘭對(duì)慢性前列腺炎大鼠行為學(xué)的影響[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 37:763- 767.

科普沙龍

人誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞可在脊髓損傷后呈長(zhǎng)距離軸突生長(zhǎng)

從一個(gè)健康的86歲男性體內(nèi)取得的多潛能干細(xì)胞(iPSCs)可分化成神經(jīng)干細(xì)胞，將其移植到脊髓損傷后有免疫缺陷的成年小鼠身上，在C5半側(cè)切3個(gè)月后，人誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(iPSCs)不但存活還分化成神經(jīng)元，其神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不但從病變部位伸長(zhǎng)出成千上萬(wàn)的軸突，并且?guī)缀跖c大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)一樣長(zhǎng)。這些誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞衍生的軸突從損傷脊髓白質(zhì)生長(zhǎng)出來(lái)，經(jīng)常穿越灰質(zhì)，并且和大鼠神經(jīng)元形成突觸。接著，宿主的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突也穿入誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞移植物并分化形成軸突。這些結(jié)果表明，內(nèi)在的神經(jīng)機(jī)制容易克服成體脊髓損傷后的抑制性微環(huán)境(inhibitory milieu)的影響，從而生長(zhǎng)出許多軸突并延伸很長(zhǎng)的距離。

擇句翻譯：

These capabilities persist even in neurons reprogrammed from very aged human cells.

即使取自很年長(zhǎng)人的重編程神經(jīng)元，它們也仍保持著這些能力。

陳至鑫 編譯自Translational Medicine 2014/6/26

章靜波 審校

Differential expression of serotonin and its receptor subtypes in spinal cord of chronic prostatitis model in rat

ZHANG Shu-rong1, ZHAO Xiu-juan1, LI Lu1, XU Chen1,2*

(1.Institute of Life Sciences; 2.Electron Microscope Room，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

ObjectiveTo study the different expressions of serotonin(5-HT) and serotonin receptor subtypes(5-HTRs) in T13～S1 spinal segments of chronic prostatitis rat models.MethodsSprague Dawley rats were randomly divided into control group，45 d，60 d and 90 d model groups. Chronic prostatitis /chronic pelvic pain syndrome of rats were induced by autoimmune. The level of 5-HT was detected by immunohistochemistry and the expression of 5-HTRsgene were detected by RT-PCR in T13～L2，L3～L4，L5～S1 spinal segments in chronic prostatitis rats.ResultsThe spontaneous pain behavior score of CP/CPPS rats was significantly higher as compared with control group (P<0.05). The levels of 5-HT in three spinal segments in all CP/CPPS model groups were decreased, 45 d and 90 d model group decreased significantly (P<0.05). The expression of 5-HTR2A，5-HTR5Ashowed a gradually increasing and 5-HT2C，5-HTR7 were increased at the first and then decreased in T13～L2 spinal segments(P<0.05). The expressions of all receptors were decline after rising first in L3～L4 spinal segments (P<0.05). The expression of 5-HT2C，5-HTR5Ashowed a gradually increasing and 5-HTR2A，5-HTR7 were decline after rising

serotonin；serotonin receptors；chronic prostatitis；spinal cord； rat

2014- 12- 25

：2015- 03- 13

重慶市自然科學(xué)基金(CSTC，2009BA5081)

*通信作者(correspondingauthor)：xuchen@cqmu.edu.cn

1001-6325(2015)05-0668-06

研究論文

R697+.33

：A

first in L5～S1 spinal segments (P<0.05).ConclusionsThere is a distinct expression pattern of 5-HT and 5-HTRsat different stages of CP/CPPS rat, suggesting that 5-HT amd its receptors may involve in the central regulation mechanism of CP/CPPS，further studies are needed for the specific mechanism.