L-谷氨酰胺治療大鼠非酒精性脂肪肝病

張 黎，牛世偉，李曉波，劉 華，黃 紅，李 燕*，李樹德

(1.云南省第一人民醫(yī)院 干部保健科，云南 昆明 650032； 2.昆明醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院, 云南 昆明 650504；3.昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650504)

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L-谷氨酰胺治療大鼠非酒精性脂肪肝病

張 黎1，牛世偉1，李曉波1，劉 華1，黃 紅1，李 燕1*，李樹德2*

(1.云南省第一人民醫(yī)院 干部保健科，云南 昆明 650032； 2.昆明醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院, 云南 昆明 650504；3.昆明理工大學 生命科學與技術學院，云南 昆明 650504)

目的觀察L-谷氨酰胺對非酒精性脂肪肝病大鼠的作用。方法將大鼠隨機分為對照組、高脂飲食組及L-谷氨酰胺治療組，高脂飲食組與L-谷氨酰胺治療組用高脂飲食建立非酒精性脂肪肝病模型，造模成功后給予相應治療，8周后處死大鼠并檢測相關指標。結果治療組相較于高脂飲食組的炎性反應明顯減輕，脂肪空泡減少；治療組的LDL、AST、TBA、 CHOL、TG、LDL-C、IL- 6、TNF-α、IL- α、IL- β、MDA及CRP較高脂飲食組明顯降低(P<0.05)，GSH、T-AOC、HDL-C明顯升高(P<0.05)，SREBF1和ACCαmRNA與蛋白表達明顯下降 (P<0.05)，PPARαmRNA及蛋白表達明顯升高(P<0.05)。結論L-谷氨酰胺可緩解大鼠非酒精性脂肪肝病癥狀，其機制可能是通過降低SREBF1及ACCα表達、同時增加PPARα表達實現(xiàn)的。

非酒精性脂肪肝；L-谷氨酰胺；肝功能；過氧化物酶體增殖物激活受體α；乙酰輔酶A羧化酶α；固醇原件調(diào)節(jié)因子1

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是代謝性疾病的一種，臨床可分為單純性非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝炎及由其后續(xù)發(fā)展造成的肝纖維化、肝硬化甚至肝癌、肝功能衰竭等[1]。當前非酒精性脂肪肝病已經(jīng)變成了威脅中國人健康的一大疾病[2]。L-谷氨酰胺是腸道必需的一種營養(yǎng)物質(zhì)，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，L-谷氨酰胺可以修復腸道L-細胞，同時可刺激腸道L細胞促進GLP-1的釋放[3]。本實驗通過高脂飲食建立非酒精性脂肪肝病大鼠模型，通過觀察大鼠肝功能、血清生化指標、炎性因子以及氧化和抗氧化能力的觀察，同時分析其肝臟固醇原件調(diào)節(jié)蛋白1(SREBP- 1c)、乙酰輔酶A羧化酶α(ACCα)以及過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα) mRNA和蛋白的表達。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源：60只清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量160～180 g，昆明醫(yī)科大學動物實驗部提供[合格證號：SYXK(滇)2011- 0004]。

1.1.2 藥物及試劑盒來源: L-谷氨酰胺(日本株式會社)；膽固醇(北京鼎盛生物科技有限公司)；膽酸鈉(上海金穗生物有限公司)；CHOL、TG、LDL-C、HDL-C、GSH、GST、T-AOC、SOD以及MDA試劑盒(南京建成生物公司)；ALT、AKP、r-GT、AST以及CRP等試劑盒(Bio-Swamp公司)；LDH試劑盒(上海谷研生物有限公司)；多克隆抗體SERBF- 1、ACC、PPARα、單克隆抗體β-actin、PVDF膜及ECL發(fā)光試劑盒(Santa Cruz公司)；相應二抗(中山金橋公司)；總RNA提取試劑盒(北京天根生物有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Merck公司)。

1.2 方法

1.2.1 非酒精性脂肪肝病模型的建立與治療方法: 60只大鼠隨機分為對照組(control，CON)、高脂飲食組(high fat group，HFD)及L-谷氨酰胺治療組(L-glutamine group，L-Gln)，每組20只，HFD組及L-Gln組給予基礎飼料+高脂溶液灌胃，高脂溶液的灌胃量為1 g豬油/100 g大鼠體質(zhì)量。12周后每組分別處死4只大鼠，檢驗造模是否成功。L-Gln治療組每天給予L-谷氨酰胺 1 g/kg 灌胃治療，8周后進行實驗觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 HE染色

CON組無任何脂滴浸潤現(xiàn)象；HFD組表面有不同程度的脂肪變性及空泡樣變；L-Gln組脂肪變性程度及細胞腫脹明顯減輕，壞死灶較HFD明顯減少，但在匯管處仍有小部分面積脂肪顆粒堆積(圖1)。

2.2 肝功能

L-Gln組與HFD組相比，LDH及AST明顯降低(P<0.05)； ALT、AKP及 r-GT 變化不明顯(表1)。

2.3 血脂

L-Gln組的CHOL、TG以及LDL-C比HFD組均有明顯的降低，HDL-C明顯升高 (P<0.05) (表2)。

2.4 血清炎性因子

L-Gln組的IL- 6、TNF-α、IL- α及IL- β較HFD組明顯降低(P<0.05)(表3)。

2.5 血清氧化和抗氧化指標比較

L-Gln組的血清GSH以及血清T-AOC較HFD組明顯升高(P<0.05)，MDA及CRP明顯降低(P<0.05)(表4)。

2.6 SREBF1、ACCα以及PPARα mRNA表達

L-谷氨酰胺治療組SREBP1及ACCαmRNA表達較HFD組明顯下降 (P<0.05)，PPARαmRNA則明顯升高(P<0.05) (圖2)。

A.CON； B.HFD； C.L-Gln圖1 肝臟切片HE染色Fig 1 HE staining of liver(×100)

表1 各組大鼠治療8周后肝功能指標比較Table 1 Comparison of liver function in rats after 8 weeks treatment(±s, u/L, n=20)

*P<0.05 compared with HFD.

表2 各組大鼠治療8周后血脂指標比較Table 2 Comparison of blood lipids in rats after 8 weeks treatment(±s, mmol/L, n=20)

*P<0.05 compared with HFD.

表3 各組大鼠治療8周后炎性因子指標比較Table 3 Comparison of inflammatory cytokines in rats after 8 weeks treatment(±s, pg/mL, n=20)

*P<0.05 compared with HFD.

表4 各組大鼠治療8周后氧化和抗氧化能力指標比較Table 4 Comparison of oxidation and antioxidant capacity in rats after 8 weeks treatment(±s, n=20)

*P<0.05 compared with HFD.

*P<0.05 compared with HFD圖2 肝臟SREBF1、ACCα 以及PPARα mRNA表達Fig 2 Expression of SREBF1, ACCα and PPARα mRNA in liver

2.7 SREBF1、ACCα 以及 PPARα蛋白表達

L-谷氨酰胺治療組SREBP1以及 ACCα 蛋白表達較HFD組有明顯下降 (P<0.05)，PPARα 蛋白表達則明顯的升高(P<0.05) (圖3)。

2.8 胰島素抵抗指數(shù)

L-Gln組胰島抵抗指數(shù)較HFD組有明顯下降 (P<0.05) (圖4)。

3 討論

目前醫(yī)學界公認的NAFLD的發(fā)病機制為“二次打擊學說”，二次打擊可分為第一次打擊和第二次打擊2個部分[4]。胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是肝臟第一擊的關鍵，IR的升高可以促進升高SREBP- 1轉錄因子，而SREBP- 1是參與脂肪合成同時促進其在肝臟聚集的關鍵酶。SREBP- 1的升高還可以促進ACCα 酶的的表達，ACCα在體內(nèi)主要參與脂肪酸的合成，二者協(xié)同作用可以促進脂肪顆粒堆積在肝臟，導致非酒精性脂肪肝的發(fā)生。谷氨酰胺可以促進GLP- 1的釋放進而治療糖尿病[5]，同時GLP- 1類似物艾塞那肽可以促進脂肪肝病的改善[6]。因此本次研究依據(jù)上述機制來觀察L-谷氨酰胺對非酒精性脂肪肝是否有作用。氧化應激是第二次打擊因子中的關鍵一環(huán)[7]。當肝細胞中脂質(zhì)的過度累積到一定程度時，會出現(xiàn)在一個或多個線粒體途徑的中心促進氧化應激，導致脂質(zhì)過氧化反應，并最終促進肝細胞的損傷，甚至導致肝細胞死亡。

*P<0.05 compared with HFD圖3 肝臟SREBF1、ACCα 以及PPARα 蛋白表達Fig 3 Expression of SREBF1, ACCα and PPARα protein in liver

*P<0.05 compared with HFD圖4 胰島素抵抗指數(shù)Fig 4 Insulin resistance index

本研究顯示，L-谷氨酰胺治療后，胰島素抵抗指數(shù)明顯降低，同時肝臟提取液中SREBP- 1和ACCα mRNA和蛋白表達在治療組均明顯低于模型對照組，血清總膽固醇、三酰甘油、LDL-C明顯降低，HDL-C明顯升高。提示谷氨酰胺可降低IR，通過IR的降低最終促進了SREBP- 1和ACCα mRNA和蛋白表達降低，最終改善了大鼠肝臟的脂肪代謝。L-谷氨酰胺治療后，大鼠PPARα mRNA和蛋白表達明顯升高，炎性因子IL- 6、TNF-α、IL- 1α、IL- 1β明顯降低，同時T-AOC及GSH明顯增加，提示過量服用谷氨酰胺可增加GSH的合成，GSH的增加促進了PPARα表達增加，最終降低了肝臟炎性反應。

綜上所述， L-谷氨酰胺可顯著降低IR，進而降低大鼠SREBP- 1和ACCα mRNA和蛋白表達，增加PPARα mRNA和蛋白表達，最終緩解了非酒精性脂肪肝病癥狀。

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[2] De Kieviet JF, Vuijk PJ, van den Berg A,etal.Glutamine effects on brain growth in very preterm children in the first year of life[J].Clin Nutr, 2013,4. 5261- 5614.

[3] Badole SL, Bagul PP, Mahamuni SP,etal.Oral L-glutamine increases active GLP- 1 (7-36) amide secretion and improves glycemic control in stretpozotocin-nicotinamide induced diabetic rats[J].Chem Biol Interact, 2013,203:530- 541.

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[5] Kotzka J, Müller-Wieland D.Sterol regulatory element-binding protein (SREBP)- 1: gene regulatory target for insulin resistance?[J].Expert Opin Ther Targets, 2004,8:141- 149.

[6] 武俊紫, 牛世偉, 賈亞敏, 等.艾塞那肽通過調(diào)控PPARα及ACOX1改善大鼠非酒精性脂肪肝病癥狀[J].基礎醫(yī)學與臨床,2014,34:464- 469.

[7] Rolo AP, Teodoro JS, Palmeira CM.Role of oxidative stress in the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis[J].Free Radic Biol Med, 2012,52:59- 69.

新聞點擊

降低尿酸有利于減少痛風并發(fā)癥

據(jù)美國WebMD醫(yī)學新聞網(wǎng)2013-11-15報道，有研究顯示，相較于沒有治療的患者，持續(xù)進行降尿酸治療的痛風患者不易發(fā)生導致慢性腎病的腎臟損傷。

研究者檢視了Kaiser Permanente數(shù)據(jù)庫中血清尿酸值大于70 mg/L的111 992名患者，其中16 186名在參與研究前的6個月內(nèi)曾經(jīng)檢查過至少1次的血清尿酸值與腎小球過濾速率，在追蹤期間至少進行1次。

從這些患者第1次紀錄有高血清尿酸值后追蹤36個月，分成以下幾類：未曾使用降尿酸治療、使用降尿酸治療的時間不到80%及使用降尿酸治療的時間超過80%。

所有接受治療的患者幾乎都有使用別嘌呤醇(allopurinol)(98.3%)。

Levy醫(yī)生表示，達到ACR指引的血清尿酸值低于60 mg/L是具有保護性的，與腎臟方面結果改善37%有關，這些患者代表的是實際情況。

生物鐘不規(guī)律影響免疫系統(tǒng)

據(jù)英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2013-11-21報道，一項新的研究認為，人體作息一旦違反生物鐘，將導致免疫系統(tǒng)受到牽連。

達拉斯得克薩斯大學西南醫(yī)學中心的免疫學家勞拉·胡珀(Lora Hooper)和她的同事專注于研究NFIL3，這是一種負責引導免疫細胞成長的蛋白質(zhì)。她們發(fā)現(xiàn)患有腸炎的小鼠體內(nèi)中的NFIL3基因發(fā)生突變，導致負責免疫的T細胞轉變成更多的TH17細胞。

Hooper嘗試把實驗室培育的T細胞中的NFIL3水平增高，發(fā)現(xiàn)轉變成TH17的細胞減少了。于是，她認為這種蛋白質(zhì)的作用是預防T細胞轉變成TH17。缺少這種蛋白質(zhì)將導致免疫細胞TH17活躍性失控、數(shù)量大增。TH17原本負責對抗細菌和真菌感染，數(shù)量多了則會導致疾病。

研究結果在最后一次的實驗中更加具體化。研究員改變了小鼠的倒時差，也就是把其晝夜的周期每4天改掉6 h，這就如同從美國飛到歐洲、印度和日本，并在每個國家住4 d。研究結果發(fā)現(xiàn)，被更改過的小鼠的腸和脾臟中的TH17數(shù)量是正常晝夜循環(huán)的2倍。這些體內(nèi)生物鐘被顛倒的小鼠在接受化學實驗的刺激下，其炎性反應更強烈。

Hooper表示，這項研究顯示了健康規(guī)律的作息對平衡免疫系統(tǒng)是非常重要的。她透露，炎性反應是許多慢性疾病的起因，如心臟病、哮喘和慢性疼痛等。

這項研究刊登在2013年11月的《科學》(Science)雜志。

L-glutamine being used to treat non-alcoholic fatty liver disease in rats

ZHANG Li1, NIU Shi-wei1，3, LI Xiao-bo1, LIU Hua1, HUANG Hong1, LI Yan1*, LI Shu-de2*

(1.the First People’s Hospital in Yunnan Province, Kunming 650032；2.School of Basic Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650504；3.School of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology, Kunming 650504, China)

ObjectiveTo observe the effect of L-glutamine on fat-induced nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) in rat.MethodsRats were randomly divided into control group, model group and L-glutamine treatment group. Build nonalcoholic fatty liver disease model after the high-fat diet in model group and L-glutamine treatment group. The appropriate treatment was given in modeling, rats were sacrificed after 8 weeks treatment to detect relevant indicators.ResultsCompared with the model group, liver pathology profile in treatment group alleviated, fat vacuoles reduced; LDL, AST, TBA CHOL, TG, LDL-C, IL- 6, TNF-α, IL- α, IL- β, MDA and CRP was significantly lower(P<0.05); GSH, T-AOC, HDL-C was significantly higher (P<0.05);SREBF1andACCαmRNA and protein expression was significantly decreased (P<0.05),PPARαmRNA and protein expression was significantly increased(P<0.05).ConclusionsL-glutamine can alleviate the symptoms of nonalcoholic fatty liver disease in rats, the mechanism may be reducing SREBF1 and ACCα expression, while

non-alcoholic fatty liver disease; L-glutamine; liver function; peroxisome proliferator activated receptor alpha; acetyl-CoA carboxylase alpha; sterol regulatory element binding transcription factor 1

2014- 11- 13

：2015- 02- 02

云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學聯(lián)合專項(2011FB225)；云南省應用基礎研究 (2013FZ183)；云南省第一人民醫(yī)院王隴德院士工作站基金(2013年)；云南省老年病防治研究中心基金(2014NS240)

*通信作者(correspondingauthor)：689963575@qq.com; shudeli006@vip.sina.com

1001-6325(2015)05-0642-05

研究論文

R965.1

：A

promoting PPARα expression achieved.

、美國加州Downey Kaiser Permanente醫(yī)療團隊風濕科的Gerald Levy醫(yī)生向出席美國風濕科學院(ACR)2013年會的記者表示，南加州的Kaiser Permanente約有360萬人，這之中有相當多腎病患者，有一些研究顯示，腎病患者會發(fā)生高尿酸血癥，有些也會發(fā)生痛風，我們想要了解逆轉尿酸血癥是否對腎病有所影響。