E-cadherin、N-cadherin及β-catenin在精原細胞瘤中表達的變化*

鄭文忠 陳劍波 張士強 劉 沖 張恩溥 李明華 李賢新**

1. 北京大學深圳醫(yī)院泌尿外科，廣東省男性生殖與遺傳實驗室（深圳 518036）；

2. 中山大學腫瘤防治中心泌尿外科； 3. 北京大學深圳醫(yī)院婦產科

E-cadherin、N-cadherin及β-catenin在精原細胞瘤中表達的變化*

鄭文忠1陳劍波1張士強2劉 沖3張恩溥1李明華1李賢新1**

1. 北京大學深圳醫(yī)院泌尿外科，廣東省男性生殖與遺傳實驗室（深圳 518036）；

2. 中山大學腫瘤防治中心泌尿外科； 3. 北京大學深圳醫(yī)院婦產科

目的 探討上皮-鈣黏素（E-cadherin）、神經(jīng)-鈣黏素（N-cadherin）及β-鏈蛋白（β-catenin）在精原細胞瘤中的表達及意義。方法 采用S-P免疫組化法檢測29例精原細胞瘤及10例正常睪丸E-cadherin、N-cadherin、β-catenin的表達水平，并進一步通過RT-PCR及蛋白免疫印跡技術（5例精原細胞瘤、5例正常睪丸）驗證。結果免疫組化染色結果顯示，正常睪丸細胞間連接處可見N-cadherin表達，而精原細胞瘤中未見N-cadherin表達；精原細胞瘤E-cadherin、β-catenin表達水平較正常睪丸顯著下降，差異有顯著性（P＜0.05）；精原細胞瘤E-cadherin、β-catenin表達水平與腫瘤TNM分期相關性分析結果無顯著性（P＞0.05， r1=0.2669， r2=-0.2280）。免疫印跡及PCR結果顯示，精原細胞瘤E-cadherin、N-cadherin、β-catenin表達水平較正常睪丸顯著下降，差異有顯著性（P＜0.05）。結論 精原細胞瘤中E-cadherin -β-catenin 復合體及N-cadherin表達較正常睪丸顯著下降，且與腫瘤TNM分期無顯著相關，提示E-cadherin、β-catenin及N-cadherin的降低可能參與精原細胞瘤的癌變過程，但與腫瘤侵襲及轉移過程無顯著相關。

精原細胞瘤； 上皮-鈣黏素； β-鏈蛋白； 神經(jīng)-鈣黏素； 上皮間質轉化

精原細胞瘤是男性睪丸惡性腫瘤中最常見的病理類型，占睪丸腫瘤30%～40%，好發(fā)年齡為35～45歲［1］。目前，精原細胞瘤發(fā)生及轉移的分子機制仍未闡明。研究表明，腫瘤浸潤轉移常存在上皮間質轉化（epithelia-mesenchymal transition， EMT）現(xiàn)象，EMT系指細胞表型由上皮轉為間質，從而獲得浸潤及轉移的能力［2］。EMT分子表型改變表現(xiàn)為上皮表型E-cadherin降低，間質表型N-cadherin上升［3，4］。E-cadherin在生殖細胞分化成熟過程中起重要作用，常與β-catenin形成復合體，通過Wnt信號通路調控多能干細胞分化方向，并在睪丸腫瘤發(fā)生及分化過程中起重要作用［5］。本研究通過免疫組化及蛋白免疫印跡方法檢測E-cadherin，β-catenin及N-cadherin在正常睪丸及精原細胞瘤中的分布及表達，探討其在精原細胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

材料與方法

一、標本收集制備

收集2008年9月至2014年9月北京大學深圳醫(yī)院泌尿外科手術切除的精原細胞瘤組織34例（石蠟包埋29例、液氮冷凍5例），年齡在28～50歲，（45.2±7.0）歲，病理診斷為睪丸精原細胞瘤；按TNM分期進行分級：Ⅰ級10例，Ⅱ級13例，Ⅲ級2例，Ⅳ級4例。正常睪丸標本15例（石蠟包埋10例、液氮冷凍5例）選自2006年9月至2014年9月我院泌尿外科因前列腺癌而接受睪丸去勢手術治療的患者，并由病理科醫(yī)師證實為正常睪丸組織?；颊咝g前未接受放療、化療及其它治療。石蠟標本（精原細胞瘤29例，正常睪丸10例）用于免疫組化實驗，冰凍標本（精原細胞瘤及正常睪丸組織各5例）用于PCR及蛋白免疫印跡實驗。本課題經(jīng)北京大學深圳醫(yī)院倫理委員會批準，且參與患者均填寫《知情同意書》。

二、主要試劑及儀器

E-cadherin兔抗人單抗（武漢博士德）；β-catenin鼠抗人多抗（武漢博士德）； N-cadherin鼠抗人單抗（武漢博士德）； UltraSensitiveTM SP（鼠/兔）試劑盒（福州邁新公司）；山羊血清工作液（福州邁新公司）； DAB（福州邁新公司）；Trizol（Invirtogen公司）；RNA逆轉錄試劑盒（Takara公司）；RIPA裂解液（上海碧云天公司）；BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天公司）；PVDF膜（上海碧云天公司）；其他常規(guī)試劑由北京大學深圳醫(yī)院廣東省男性生殖與遺傳重點實驗室供應。

三、免疫組化（S-P法）

石蠟包埋標本連續(xù)切片，片厚4μm，60℃溫箱烘干后備用。石蠟切片脫蠟水化處理，0.3%過氧化氫封閉組織內源性過氧化物酶15min，抗原經(jīng)pH9.0 EDTA微波修復25min，冷卻60min至室溫。山羊血清工作液室溫孵育50min，一抗（E-cadherin，β-catenin，N-cadherin）4℃過夜，二抗（羊抗兔IgG聚合物，羊抗鼠IgG聚合物）37℃溫箱孵育30min，辣根過氧化物標記生物素37℃溫箱孵育30min，DAB顯示，蘇木素復染細胞核，水化透明，中性樹膠封片。陽性組織切片作陽性對照，抗體對應IgG代替一抗為陰性對照。

四、RT-PCR

Trizol法提取組織總RNA，通過RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒進行RT-PCR。引物序列分別為：E-cadherin：5’-TTCTGTGAGAGGAATCCA-3’；5’-GTGTTAGTTCTGCTGTGA-3’。N-cadherin：5’-TCATCATCCTGCTTATCC-3’；5’-ATTATCTCTTACATCATCTTCTG-3’。β-catenin：5’-TGACCAACAGAAACCTTT-3’；5’CCAATCAGACCTCTTCAC-3’。GAPDH：5’-CTCCGGGAAACTGTGGCGTG-3’；5’-ACAAAGTGGTCGTTGAGGGCA-3’。RT-PCR產物于2%瓊脂糖凝膠電泳。以GAPDH為內對照，計算積分吸光值IA。

五、蛋白免疫印跡

冰凍組織于RAPI裂解液中研磨，4℃、13 800×g，離心30min，分離上清，經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，樣品加入2×上樣緩沖液，煮沸變性7min，4℃、13 800×g，離心20min，取50μg總蛋白于30mA/塊膠12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳90min。轉移至硝酸纖維素膜（PVDF膜），7.5% 脫脂奶粉室溫封閉3h，抗體（E-cadherin，β-catenin，N-cadherin，β-tublin）4℃冰箱搖床過夜，二抗（羊抗兔IgG聚合物，羊抗鼠IgG聚合物）室溫孵育1h，顯影曝光，利用Quantity one軟件掃描PVDF膜上蛋白信號條帶，計算積分吸光值IA。

六、統(tǒng)計學方法

對免疫組化圖像采集者實施盲法，每個標本病變典型處采集5個高倍視野（HPF×400）。每個視野通過圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0（IPP6.0）進行積分吸光度（LA）值測量，結果以表示，數(shù)據(jù)由R 3.0.1軟件處理，組間比較采用樣本均數(shù)間t檢驗進行分析，因素間關系采用Spearman相關檢驗分析，P＜0.05為差異有顯著性。

結 果

一、免疫組織化學染色結果

正常睪丸支持細胞間緊密連接處及精子均可見E-cadherin表達，精原細胞瘤E-cadherin主要表達于腫瘤胞漿。β-catenin、N-cadherin表達于正常睪丸支持細胞間緊密連接處，精原細胞瘤未見N-cadherin表達，β-catenin表達于腫瘤細胞胞漿。精原細胞瘤E-cadherin、β-catenin表達水平與腫瘤TNM分期相關性分析結果無顯著性（P＞0.05，r1=0.2669， r2=-0.2280），見圖1。

圖1 E-cadherin、β-catenin、N-cadherin在睪丸組織中的表達及其與腫瘤TNM分期的相關性A： 正常睪丸及精原細胞瘤中E-cadherin、β-catenin、 N-cadherin的分布及表達（×200， ×400）； B： E-cadherin、β-catenin與腫瘤TNM分期的相關性分析

二、RT-PCR結果

E-cadherin、β-catenin、 N-cadherin在正常睪丸及精原細胞瘤中均有表達，E-cadherin條帶位置為91bp， N-cadherin條帶位置為113bp，β-catenin條帶位置為144bp，GAPDH條帶位置為351bp。正常睪丸及精原細胞瘤E-cadherin積分吸光值分別為（54.45±3.85）、（5.43±2.78），差異有顯著性（P＜0.05）。正常睪丸及精原細胞瘤N-cadherin積分吸光值分別為（6.39±1.21）、（1.08±1.04），差異有顯著性（P＜0.05）。正常睪丸及精原細胞瘤β-catenin積分吸光值分別為（92.02±3.49）、（6.37±1.15），差異有顯著性（P＜0.05），見圖2。

三、蛋白免疫印跡結果

E-cadherin、β-catenin、 N-cadherin在正常睪丸及精原細胞瘤中均有表達。E-cadherin條帶位置為100kDa，β-catenin條帶位置為90kDa，N-cadherin

圖2 RT-PCR分析E-cadherin、N-cadherin、β-catenin在睪丸組織中的表達A、B、C分別為E-cadherin、N-cadherin、β-catenin在正常睪丸及精原細胞瘤中表達差異比較

A B C條帶位置為97kDa，β-tublin條帶位置為55KDa。正常睪丸及精原細胞瘤E-cadherin蛋白積分吸光值分別為（50.50±6.35）、（27.00±7.00），差異有顯著性（P＜0.05）。正常睪丸及精原細胞瘤N-cadherin蛋白積分吸光值分別為（51.00±5.61）、（27.00±9.00），差異有顯著性（P＜0.05）。正常睪丸及精原細胞瘤β-catenin蛋白積分吸光值分別為（37.60±3.23）、（13.80±1.60），差異有顯著性（P＜0.05），見圖 3。

討 論

精子發(fā)生指生精細胞在睪丸內經(jīng)過一系列結構和功能改變，由生精上皮基底側遷移至近腔側，最終發(fā)育為精子的過程。睪丸內細胞間黏附在精子發(fā)生過程中起重要作用。支持細胞可通過細胞間黏附為各級生精細胞提供營養(yǎng)支持并維系其結構穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，鈣黏附蛋白超家族成員在睪丸細胞間黏附中起重要作用［6］。E-cadherin是一類鈣離子依賴性的跨膜糖蛋白，主要分布于各類上皮細胞膜上，由5個胞外區(qū)、一個跨膜區(qū)及胞內區(qū)構成，在細胞間黏附及信號轉導過程中起重要作用［7］。Cadherins參與維持睪丸支持細胞極性、精子發(fā)生及腔內遷移等過程［8］。近期研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin在睪丸腫瘤發(fā)生過程中起關鍵作用［9］。腫瘤浸潤轉移常存在EMT現(xiàn)象， EMT分子表型改變表現(xiàn)為上皮表型E-cadherin降低，而間質表型N-cadherin升高［2］。

圖 3 蛋白免疫印跡分析E-cadherin、β-catenin、N-cadherin在睪丸組織中的表達A： 正常睪丸及精原細胞瘤中E-cadherin、β-catenin、 N-cadherin的表達； B： 兩組間不同蛋白表達水平比較

本實驗采用免疫組織化學方法分析正常睪丸及精原細胞瘤中E-cadherin的分布及表達。與之前研究報道［9］，E-cadherin僅存于正常睪丸細胞間連接處不同。我們發(fā)現(xiàn)睪丸支持細胞間緊密連接處及精子均可見E-cadherin表達，說明精子在進入附睪成熟前已有E-cadherin表達。研究表明，E-cadherin在精子中的定位隨精子成熟而改變，從最初表達于精子頭部到成熟后定位于精子赤道板及頂體后區(qū)，并在精子獲能及精卵融合過程中起重要作用［10，11］。實驗發(fā)現(xiàn)精原細胞瘤E-cadherin主要表達于腫瘤胞漿。蛋白免疫印跡及RT-PCR結果顯示精原細胞瘤E-cadherin表達較正常睪丸顯著下降（P＜0.05）。通過分析精原細胞瘤免疫組化積分吸光度與腫瘤TNM分期的相關性，發(fā)現(xiàn)E-cadherin與腫瘤分期無顯著相關（P＞0.05，r1=0.2669）。

N-cadherin為鈣依賴介導細胞間黏附的一類分子，主要分布于成人神經(jīng)組織、肌肉及晶狀體，與腫瘤演進密切相關。在多種腫瘤中N-cadherin上調，并增強腫瘤細胞侵襲性［12，13］。實驗發(fā)現(xiàn)正常睪丸近基底部支持細胞緊密連接處可見N-cadherin表達，而與乳腺癌等腫瘤N-cadherin變化趨勢相反，精原細胞瘤中未見其表達。N-cadherin與正常生精過程密切相關［14］，因為在正常生精過程中，精原細胞分裂及各級生精細胞有基底部向腔內遷移的過程需要N-cadherin。蛋白免疫印跡及RT-PCR結果顯示精原細胞瘤少量表達N-cadherin，且較正常睪丸顯著下降（P＜0.05）。表明N-cadherin在精原細胞瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有特殊作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，正常卵巢上皮細胞表達N-cadherin，而惡性卵巢腫瘤中N-cadherin下調，其變化趨勢與精原細胞瘤相似［15］。體外實驗顯示，N-cadherin作為正常卵巢上皮細胞的存活因子，并抑制腫瘤的形成［16］。我們推測，睪丸中N-cadherin的作用與卵巢上皮細胞類似，即N-cadherin作為正常睪丸內生精細胞及支持細胞的存活因子，在維持睪丸支持細胞極性、精子發(fā)生及腔內遷移等過程起重要作用，并抑制腫瘤細胞的形成。

腫瘤浸潤轉移常存在EMT現(xiàn)象，EMT分子表型改變表現(xiàn)為上皮表型E-cadherin降低，間質表型N-cadherin升高。分析比較E-cadherin及N-cadherin在正常睪丸及精原細胞瘤中表達變化，正常睪丸中支持細胞與生精細胞存在類似EMT的現(xiàn)象，而精原細胞瘤未見典型EMT現(xiàn)象。由此提示，EMT在維持睪丸支持細胞極性、精子發(fā)生及腔內遷移等過程中可能起重要作用，而在精原細胞瘤發(fā)生及侵襲、轉移等生物學過程中不起主要作用。所以，E-cadherin、N-cadherin可能僅在精原細胞瘤發(fā)生過程中起作用，而不影響腫瘤侵襲、轉移。

E-cadherin常與β-catenin形成復合體，通過Wnt信號通路調控多能干細胞分化方向。正常睪丸E-cadherin-β-catenin復合體參與構成支持細胞間的連接。β-catenin是一類多功能信號轉導分子，在睪丸生精細胞與支持細胞間黏附及胞內信號轉導過程中發(fā)揮關鍵作用［17］。β-catenin 在睪丸腫瘤發(fā)生及分化過程中起重要作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)，過度激活Wnt/β-catenin信號通路與小鼠睪丸支持細胞瘤的發(fā)生密切相關［18］。胞內β-catenin升高是Wnt信號通路激活的典型表現(xiàn)［19］。免疫組織結果顯示，β-catenin僅表達于正常睪丸支持細胞間近基底部緊密連接處，呈環(huán)形緊扣生精細胞，精原細胞瘤胞漿內可見β-catenin表達。我們推測：一方面，精原細胞瘤發(fā)生過程中細胞連接處E-cadherin-β-catenin下調，破壞細胞間連接，進而影響正常生精過程；另一方面，腫瘤細胞胞內β-catenin出現(xiàn)，提示W(wǎng)nt/ β-catenin信號通路激活可能在腫瘤發(fā)生過程中起重要作用。蛋白免疫印跡及RT-PCR結果顯示精原細胞瘤β-catenin與E-cadherin表達一致，較正常睪丸顯著下降（P＜0.05）。通過分析精原細胞瘤免疫組化積分吸光度與腫瘤TNM分期的相關性，發(fā)現(xiàn)β-catenin與腫瘤分期無顯著相關（P＞0.05， r2=-0.2280）。提示E-cadherin-β-catenin復合體可能僅在精原細胞瘤發(fā)生過程中起作用，而不影響腫瘤侵襲及轉移。

綜上所述，通過分析正常睪丸及精原細胞瘤中E-cadherin、 β-catenin、 N-cadherin的分布及表達，本實驗發(fā)現(xiàn)精原細胞瘤中E-cadherin 、β-catenin、N-cadherin表達較正常睪丸顯著下降，且與腫瘤TNM分期及EMT無顯著相關，提示E-cadherin 、β-catenin、N-cadherin的低表達可能導致精原細胞瘤的發(fā)生，而精原細胞瘤侵襲及轉移的生物學過程可能存在一種不同于EMT的途徑。本研究分析了E-cadherin 、β-catenin、N-cadherin在正常睪丸及精原細胞瘤中的表達及分布，進一步將深入研究其在腫瘤發(fā)生中的分子機制。

1 劉仁偉， 吳志清， 馮豐坔， 等. 睪丸精原細胞瘤的MRI表現(xiàn). 中國醫(yī)學影像技術 2012； 28（5）： 982-985

2 Kokkinos MI， Wafai R， Wong MK， et al. Vimentin and epithelial-mesenchymal transition in human breast cancer observations in vitro and in vivo. Cells Tissues Organs 2007； 185（1-3）： 191-203

3 Saitoh M， Shirakihara T， Miyazono K. Regulation of the stability of cell surface E-cadherin by the proteasome. Biochem Biophys Res Commun 2009； 381（4）： 560-565

4 Cavallaro U， Schaffhauser B， Christofori G. Cadherins and the tumour progression： is it all in a switch？ Cancer Lett 2002； 176（2）： 123-128

5 Honecker F， Kersemaekers AM， Molier M， et al. Involvement of E-cadherin and beta-catenin in germ cell tumours and in normal male fetal germ cell development. J Pathol 2004； 204（2）： 167-174

6 Johnson KJ， Patel SR， Boekelheide K. Multiple cadherin superfamily members with unique expression pro les are produced in rat testis. Endocrinology 2000； 141（2）： 675-683

7 Obrink B. Epithelial cell adhesion molecules. Exp Cell Res 1986； 163（1）： 1-21

8 趙麗， 刁瑞英， 劉曉翌， 等. E-cadherin在精子發(fā)生及精卵融合過程中的作用. 中國優(yōu)生與遺傳雜志 2012；20（1）： 1-2， 4

9 Batistatou A， Scopa CD， Ravazoula P， et al. Involvement of dysadherin and E-cadherin in the development of testicular tumours. Br J Cancer 2005； 93（12）： 1382-1387

10 Purohit S， Brahmaraju M， Palta A， et al. Impaired E-cadherin expression in human spermatozoa in a male factor infertility subset signi es E-cadherin-mediated adhesion mechanisms operative in sperm-oolemma interactions. Biochem Biophys Res Commun 2004；316（3）： 903-909

11 Fazeli A， Duncan AE， Watson P， et al. Sperm-oviduct interaction： induction of capacitation and preferential binding of uncapacitated spermatozoa to oviductal epithelial cells in porcine species. Biol Reprod 1999； 60（4）：879-886

12 Li G， Satyamoorthy K， Herlyn M. N-cadherin-mediated intercellular interactions promote survival and migration of melanoma cells. Cancer Res 2001； 61（9）： 3819-3825

13 Hazan RB， Phillips GR， Qiao RF， et al. Exogenous expression of N-cadherin in breast cancer cells induces cell migration， invasion， and metastasis. J Cell Biol 2000；148（4）： 779-790

14 Newton SC， Blaschuk OW， Millette CF. N-cadherin mediates Sertoli cell-spermatogenic cell adhesion. Dev Dyn 1993； 197（1）： 1-13

15 Marques FR， Fonsechi-Carvasan GA， De Angelo Andrade LA， et al. Immunohistochemical patterns for alpha- and beta-catenin， E- and N-cadherin expression in ovarian epithelial tumors. Gynecol Oncol 2004； 94（1）： 16-24

16 Pon YL， Auersperg N， Wong AS. Gonadotropins regulate N-cadherin-mediated human ovarian surface epithelial cell survival at both post-translational and transcriptional levels through a cyclic AMP/protein kinase A pathway. J Biol Chem 2005； 280（15）： 15438-1544817 Maiese K， Li F， Chong ZZ， et al. The Wnt signaling pathway： aging gracefully as a protectionist？ Pharmacol Ther 2008； 118（1）： 58-81

18 Chang H， Guillou F， Taketo MM， et al. Overactive betacatenin signaling causes testicular sertoli cell tumor development in the mouse. Biol Reprod 2009； 81（5）： 842-849

19 Tanwar PS， Kaneko-Tarui T， Zhang L， et al. Constitutive WNT/beta-catenin signaling in murine Sertoli cells disrupts their differentiation and ability to support spermatogenesis. Biol Reprod 2010； 82（2）： 422-432

（2015-03-28收稿）

Expression of E-cadherin， N-cadherin and β-catenin in seminomas*

Zheng Wenzhong1， Chen Jianbo1， Zhang Shiqiang2， Liu Chong3， Zhang Enpu1， Li Minghua1， Li Xianxin1**
1. Department of Urology， Peking University Shenzhen Hospital； Guangdong Key Labrotory of Male Reproductive and Genetic，Shenzhen ， Guang dong 518036， China； 2. Department of Urology， Sun Yat-sen University Cancer Center；
3. Department of Gynaecology and Obstetrics， Peking University Shenzhen Hospital Corresponding author： Li Xianxin， E-mail： xianxinli@163.com

Objective To investigate the expressions of E-cadherin、N-cadherin and β-catenin in seminomas and their signi cance in the development of seminomas. Methods The expressions of E-cadherin、N-cadherin and β-catenin in 26 seminomas tissues and 10 normal testicular tissues were detected by immunohistochemical staining， of which the relationships to clinical feature of seminomas and to EMT were analyzed. The expression level of E-cadherin， N-cadherin and β-catenin were further con rmed by RT-PCR and Western Blot. Results E-cadherin and β-catenin were detected in all normal testicular tissues and seminomas. N-cadherin were detected in tight junctions （TJs） and adherin junctions（AJs） between sertoli cells. Immunohistochemical staining showed that there were absent N-cadherin in testicular tissues of seminomas. Downregulation of Ecadherin-β-catenin complexes in seminomas were not correlated with TNM stages （P＞0.05，r1=0.2669， r2=-0.2280）. RT-PCR and WesternBlot results indicated that the expression of E-cadherin， N-cadherin andβ-catenin were all signi cantly decreased in testicular tissue of seminomas patients as compared with that in normal testis tissues （P＜0.05）. Conclusion Low expression of Ecadherin-β-catenin complexes in seminomas were not correlated with TNM stags and no signi cant EMT was found in the testicular cancer， indicating that those proteins may play an important role in tumorigenesis but not metastasis of seminomas.

seminoma； E-cadherin； β-catenin； N-cadherin； EMT

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.07.003

R 737.21

資助： 本課題受國家自然科學基金（No.81572513）； 廣東省自然科學基金（S2012010008200）；深圳市科技創(chuàng)新委員會基礎研究計劃（JCYJ20150403091443334）資助**

， E-mail： xianxinli@163.com