預(yù)測微生物學(xué)在低溫儲存原料乳中的應(yīng)用

趙金海，段楠，常存，姚鴻賓，王東凱，王雷（.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江哈爾濱50020；2.黑龍江省北安市紅星農(nóng)場，黑龍江北安64022）

預(yù)測微生物學(xué)在低溫儲存原料乳中的應(yīng)用

趙金海1，段楠2，*，常存1，姚鴻賓1，王東凱1，王雷1
（1.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江哈爾濱150020；2.黑龍江省北安市紅星農(nóng)場，黑龍江北安164022）

摘要：隨著冷藏設(shè)備的廣泛應(yīng)用，嗜冷菌及其耐熱代謝產(chǎn)物成為影響原料乳質(zhì)量和乳制品質(zhì)量的主要因素。以奶站的新鮮原料乳為研究對象，研究春季原料乳中總菌落和嗜冷菌在不同儲存溫度下的生長情況。使用Gompertz模型建立4℃～14℃儲存的原料乳中總菌落和嗜冷菌的生長動力模型，模型可以有效的模擬原料乳中微生物的生長情況。低溫儲存的原料乳中總菌數(shù)與嗜冷菌有一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：原料乳；嗜冷菌；預(yù)測微生物學(xué)

乳品是易腐的食品，如果儲存在不恰當(dāng)?shù)臈l件下，就會發(fā)生腐敗菌和致病菌的生長，諸如乳酸菌、假單胞菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌、大腸桿菌O157∶H7、和沙門氏菌此類的致病菌。隨著冷藏設(shè)備的廣泛應(yīng)用，嗜冷菌成為影響保質(zhì)期的主要因素。

Ingram將耐冷菌定義為能在≤5℃的條件下生長的微生物[1]。為了便于區(qū)別，將“Psychrophile”稱為專性嗜冷菌，除去“Psychrophile”部分的“Psychrotroph”稱為兼性嗜冷菌，兩者合稱嗜冷菌。Morita根據(jù)微生物最適生長溫度以及生長上下限溫度對嗜冷菌作出了定義，認(rèn)為嗜冷菌（Psychrophiles）就是指那些最適生長溫度等于或低于15℃，上限溫度等于或低于20℃的微生物的總稱[2]。在已經(jīng)了解的嗜冷菌中，細(xì)菌就有30多個屬，常見如假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、無色桿菌屬、黃桿菌屬、克雷伯氏菌屬[3-4]。Craven和Macauley報導(dǎo)86.8%的從4℃儲存的巴氏消毒乳中分離的嗜冷菌屬于假單胞菌屬[5]。吳石金等從155份原料乳樣品中分離純化得到嗜冷菌分離物16株，經(jīng)微生物分類學(xué)性狀特點鑒定，確定為假單胞菌10株，微球菌4株，產(chǎn)堿桿菌2株[6]。

假單胞菌屬和芽胞桿菌屬產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶在生產(chǎn)乳和乳粉的加熱工序后還有活力，當(dāng)菌體被殺死后釋放到液體奶中。Matta和Santo曾報道原料乳中嗜冷菌產(chǎn)生的胞內(nèi)蛋白酶與超高溫滅菌乳（ultra heat treated，UHT）奶膠凝有關(guān)[7-8]。嗜冷菌污染是現(xiàn)代乳制品加工過程中最常見的問題，大多數(shù)嗜冷菌在4℃～6℃貯存時，能產(chǎn)生耐熱的酶類如蛋白酶、脂肪酶等，這些酶能耐受巴氏消毒甚至UHT處理，導(dǎo)致乳及乳制品風(fēng)味、品質(zhì)降低，縮短保質(zhì)期。

使用預(yù)測模型對食品中的微生物的生長情況進(jìn)行預(yù)測，成為食品行業(yè)研究的熱點，預(yù)測模型已經(jīng)可以應(yīng)用在蔬菜[9-11]、肉制品[12-14]、水產(chǎn)品[15-16]和乳制品等[17-18]食品中，因此本研究利用預(yù)測模型對原料乳中的微生物生長情況進(jìn)行預(yù)測，以期達(dá)到快速估算原料乳中微生物數(shù)量的目的。

1　材料與方法

1.1原料與試劑

新鮮機(jī)械榨取1h內(nèi)的牛乳，在5 t乳罐中攪拌并快速冷卻至4℃，從乳罐中取乳樣50 kg，使用碎冰屑保持低溫，樣品在30 min內(nèi)送到實驗室。將原料乳混勻后進(jìn)行無菌分裝，每只滅菌的1 000 mL三角瓶大約分裝500 mL乳樣。放入指定保藏溫度的搖床，以80 r/min振蕩培養(yǎng)。

營養(yǎng)瓊脂：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；脫脂乳粉：黑龍江省完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2主要儀器與設(shè)備

DELTA320pH計、AL-204分析天平：上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司；JD500-2電子天平：沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；ZDX-30KBS自動滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HZQ-F160全溫震蕩培養(yǎng)箱、DL-CJ-1N醫(yī)用超凈工作臺：哈爾濱東聯(lián)公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌落總數(shù)的測定

采用GB/T4789.2-2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》方法檢測菌落總數(shù)[19]，對不同儲存溫度和時間的原料乳中菌落總數(shù)進(jìn)行測定。

1.3.2嗜冷菌的測定

采用ISO 17410-2001《Milk enumeration of psychrotrophic microorganismscolony count technique at 6.5℃》方法檢驗嗜冷菌數(shù)[20]，對不同儲存溫度和時間的原料乳中嗜冷菌菌數(shù)進(jìn)行測定。

1.3.3乳中微生物生長曲線的測定

每隔一定的時間取出3個平行試樣，用0.85%生理鹽水分別對3個試樣中的牛乳進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使菌濃度控制在103cfu/mL～104cfu/mL，在無菌條件下移取0.1 mL牛乳作平板涂布并測定此時間點的菌數(shù)，每個試樣做3次平行試驗。用平板計數(shù)法測定菌落數(shù)，數(shù)據(jù)取3個平行試驗的平均值。

1.3.4微生物生長預(yù)測模型的建立

初級模型的制作使用SAS軟件對微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用Gompertz模型建立初級生長預(yù)測模型。

2　結(jié)果與分析

由圖1、圖2和表1相應(yīng)的生長動力模型可以得出，隨著儲存溫度的升高，總菌數(shù)達(dá)到最大生長速率的時間逐漸減少，從4℃儲存的11.4 h降到14℃儲存的9.7 h，達(dá)到穩(wěn)定期的微生物增長量也隨著儲存溫度的升高而增加，從4℃儲存的1.76 log10cfu/mL升增加到8℃儲存的2.48log10cfu/mL，從10℃儲存的1.46 log10cfu/mL升高到14℃儲存的1.83 log10cfu/mL。

嗜冷菌菌數(shù)達(dá)到最大生長速率的時間從4℃儲存的15.1 h降到14℃儲存的5.4 h，達(dá)到穩(wěn)定期的微生物增長量也隨著儲存溫度的升高而增加，但是在14℃時候出現(xiàn)下降，從4℃儲存的1.23 log10cfu/mL增加到12℃儲存的1.66 log10cfu/mL。嗜冷菌的最大增長量占總菌落的最大增長量的絕大部分甚至超過，可知在春季低溫儲存的原料乳中嗜冷菌是生長繁殖的優(yōu)勢菌。

使用Gompertz模型建立的原料乳中總菌生長動力模型的R2﹥0.96，嗜冷菌生長動力模型的R2﹥0.92，表明使用Gompertz模型建立的4℃～14℃儲存春季原料乳中總菌和嗜冷菌的生長動力模型是適合的，模型可以有效的模擬春季原料乳中微生物的生長情況。

圖1　原料乳在不同儲存溫度條件下總菌落生長模型Fig.1　The growth model of total colony in the raw milk of spring at different storage temperature conditions

圖2　原料乳在不同儲存溫度條件下嗜冷菌生長模型Fig.2　The growth model of psychrophile in the raw milk of spring at different storage temperature conditions

表1 春季微生物生長模型Table 1　The microbial growth model in spring

表2　總菌落數(shù)（x）與嗜冷菌數(shù)量（Y）的關(guān)系Table 2　The relationship between total colony（x）and psychrophilic（Y）

在較低的儲存溫度條件下原料乳中嗜冷菌是主要增長的微生物[21-22]。試驗表明在4℃～14℃儲存條件下的嗜冷菌增長的數(shù)目占總菌增長數(shù)目的大部分，這與儲存條件和嗜冷菌自身的性質(zhì)有關(guān)，在較低的儲存溫度條件下，嗜溫微生物生長緩慢，但是嗜冷菌仍然可以較快地生長。

將試驗中獲得的總菌數(shù)和嗜冷菌數(shù)分別取對數(shù)，以總菌落數(shù)的對數(shù)值為x，嗜冷菌數(shù)量的對數(shù)值為Y，繪制圖3。

由圖3和表2可以得出，總菌落數(shù)隨著嗜冷菌的數(shù)量增長而增加，呈正相關(guān)，在4℃～8℃儲存溫度下相關(guān)系數(shù)較高，為0.92，但是10℃～14℃儲存溫度下相關(guān)系數(shù)較低，為0.70。

CEMPíRKOVá在1999至2000年的研究表明，原料乳嗜冷菌與菌落總數(shù)有相關(guān)性，相關(guān)性達(dá)到0.92[23]，本試驗研究結(jié)果與CEMPíRKOVá的研究結(jié)果相似。可以利用原料乳嗜冷菌與菌落總數(shù)有相關(guān)性這種關(guān)系，根據(jù)菌落總數(shù)快速推斷出嗜冷菌的大致數(shù)量。

圖3　不同季節(jié)總菌落數(shù)與嗜冷菌數(shù)量的關(guān)系Fig.3　The relationship between total colony and psychrophilic in raw milk of different seasons

3　結(jié)論

本研究以哈爾濱地區(qū)小型奶站的新鮮原料乳為研究對象，春季的原料乳中微生物在不同儲存溫度下的生長情況和相應(yīng)指示物的變化情況，使用改進(jìn)Gompertz模型建立4℃～14℃儲存的春季原料乳中總菌落和嗜冷菌的生長動力模型，模型相關(guān)系數(shù)均大于0.92，可以用來預(yù)測微生物生長情況。

研究表明低溫儲存的春季原料乳中總菌數(shù)與嗜冷菌有一定的相關(guān)性，在4℃～8℃儲存溫度下總菌落數(shù)與嗜冷菌的數(shù)量呈很好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.92，實際生產(chǎn)中可以通過總菌數(shù)推算出嗜冷菌的數(shù)量加快檢測速度。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.045

收稿日期：2014-08-05

基金項目：黑龍江省科學(xué)院預(yù)研項目（YY1301）

作者簡介：趙金海（1987—），男（漢），工程師，碩士，主要從事微生物方向研究。

*通信作者：段楠（1986—），女（漢），工程師，學(xué)士，主要從事食品微生物方向研究。

Application in Low-temperature Storage of Raw Milk of Predictive Microbiology

ZHAO Jin-hai1，DUAN Nan2，*，CHANG Cun1，YAO Hong-bin1，WANG Dong-kai1，WANG Lei1
（1.Heilongjiang Province High Academy of Sciences Institute of Technology，Haerbin 150020，Heilongjiang，China；2.Beianshi Hongxing Farm in Heilongjiang Province，Beian 164022，Heilongjiang，China）

Abstract：With the extensive application of refrigeration equipments，psychrophile and its metabolites，which are themoduric，will be a major factor to affect the quality of raw milk and dairy products.The study points to fresh raw milk as the object and sets up the corresponding Microbial primary growth model by researching total bacteria and psychrophilic of the raw milk at different temperature in spring.Setting up by Gompertz，the growth kinetic model of total colony and psychrophilic in raw milk，which has been stored at between 4℃and 14℃，it can effectively simulate and predict microorganism growth.The study shows that there is a dependability between total colony and psychrophilic in raw milk at low temperature.

Key words：raw milk；Psychrophili；predictive microbiology