液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定植物油中的4種沒食子酸酯

董貴軍，喬勇升，李興根，韓芷玲，胡慧，馮寅潔，陳偉（泰州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇泰州225300）

液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定植物油中的4種沒食子酸酯

董貴軍，喬勇升*，李興根，韓芷玲，胡慧，馮寅潔，陳偉
（泰州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇泰州225300）

摘要：建立了食用植物油中沒食子酸酯類化合物測(cè)定的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品經(jīng)正己烷飽和的乙睛萃取后，采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱分離，以0.1%甲酸水和甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，電噴霧電離負(fù)離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。4種沒食子酸酯類化合物的檢出限（S/N=3）為0.02 mg/kg～0.05 mg/kg，定量限（S/N=10）為0.06 mg/kg～0.15 mg/kg；在0.20、0.50、0.80 mg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平下回收率為75.4%～91.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9.2%。應(yīng)用建立的方法對(duì)市售食用植物油產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)定，未發(fā)現(xiàn)4種沒食子酸酯類化合物。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；沒食子酸酯類化合物；食用植物油；沒食子酸丙酯；沒食子酸異戊酯；沒食子酸辛酯；沒食子酸月桂酯

沒食子酸（gallic acid，GA），化學(xué)名3，4，5-三羥基苯甲酸，是可水解鞣質(zhì)的組成部分，廣泛存在于葡萄，茶葉等植物中，是自然界存在的一種多酚類化合物[1]。以沒食子酸為原料可以人工合成沒食子酸酯類化合物，其脂溶性顯著增強(qiáng)，且沒食子酸酯類化合物分子中有3個(gè)酚羥基處于鄰位，是質(zhì)子的供體，表現(xiàn)出活潑的還原性，具有良好的抗氧化活性[2]和抑菌性能[3]。沒食子酸酯類化合物的烷基酯根據(jù)烷基碳原子個(gè)數(shù)可分為低級(jí)酯（如甲酯、乙酯、丙酯等）和高級(jí)酯（如辛酯、月桂酯等），其中沒食子酸丙酯是（Propyl gallate，簡(jiǎn)稱PG）常作為抗氧化劑應(yīng)用于食品工業(yè)。雖然沒食子酸丙酯的毒性被認(rèn)為低于丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）與特丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）[4]，但仍有報(bào)道稱沒食子酸酯這類人工合成抗氧化劑的過量使用仍會(huì)對(duì)人體健康造成危害，如過敏性炎癥[5]等。

人工合成食品添加劑的使用安全性越來越受到關(guān)注，對(duì)其使用量也有嚴(yán)格的規(guī)定。我國(guó)的食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[6]規(guī)定沒食子酸丙酯在脂肪和油、熟制堅(jiān)果與籽類、油炸和方便米面制品、餅干、腌臘肉制品類、干制水產(chǎn)品、雞肉粉和膨化食品中的最大使用量不得超過0.1 g/kg、膠基糖果中不得超過0.4 g/kg。而沒食子酸異戊酯（Isoamyl Gallate，簡(jiǎn)稱IAG）、沒食子酸辛酯（Octyl gallate，簡(jiǎn)稱OG）、沒食子酸月桂酯（Dodecyl gallate，簡(jiǎn)稱DG）未被GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》確認(rèn)為允許使用的食品添加劑品種。

沒食子酸酯類化合物檢測(cè)常用的方法有分光光度計(jì)法[7]、液相色譜法[8-11]、毛細(xì)管電泳法[12]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要采用分光光度計(jì)法[13]和液相色譜法[14-15]對(duì)PG進(jìn)行檢測(cè)。本文建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)食用植物油中沒食子酸酯類化合物進(jìn)行定性定量分析的檢測(cè)方法，快速簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確靈敏，為沒食子酸酯類化合物的檢測(cè)提供了有利工具。

1　試驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀、Waters Micromass Quattro Premier XE三重四極桿質(zhì)譜儀、Mass-Lynx V4.1數(shù)據(jù)處理操作平臺(tái)：美國(guó)Waters公司；Millipore純水系統(tǒng)，配有Milli-Q Academic超純水器和RiOs反滲透水純化系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；Sartorius CP225D型電子分析天平，感量為0.000 01 g：德國(guó)Sartorius公司。

G（純度≥99.0%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；IAG（純度≥98.5%）、OG（純度≥98.5%）：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；DG（純度≥99.0%）：美國(guó)Fluka公司；乙腈、甲醇、正己烷（HPLC級(jí)）：迪馬科技有限公司；甲酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；試驗(yàn)用水均為超純水：Millipore公司超純水系統(tǒng)制備，電阻率為18.2 MΩ·cm；Acrodisc GHP雙性濾膜（0.2 μm）：美國(guó)PALL公司；氮?dú)?、氦氣（純?99.999%）：南京特種氣體廠有限公司。

沒食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液：各自稱取沒食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品適量，用少量甲醇溶解，并用甲醇定容至50 mL，配成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于4℃冰箱避光保存。使用時(shí)根據(jù)需要用空白樣品提取液配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2儀器工作條件

液相色譜條件：WatersACQUITYUPLCHSST3色譜柱（2.1mm×50 mm，1.7μm）；柱溫30℃；流量0.3mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸水溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0 min～1.0 min，B 為28%；1.0 min～1.4min，B由28%升至70%；1.4 min～1.9 min，B由70%升至90%；保持0.9 min；2.8 min～2.9 min，B由90%降至28%；保持1 min。

質(zhì)譜條件：電噴霧負(fù)離子源ESI（-），離子源溫度120℃，毛細(xì)管電壓3.0 kV，RF透鏡電壓0.5 V，脫溶劑溫度300℃，脫溶劑氣流量600 L/h，錐孔氣流量50 L/h，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），其他參數(shù)見表1。

表1　4種沒食子酸酯的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1　UPLC-MS/MS acquisition parameters for the 4 gallates

1.3試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取植物油樣品2 g（精確至0.000 1 g）于具塞離心管中，加人5 mL乙睛飽和的正己烷，漩渦混合3 min～5 min以充分溶解油樣，加人10 mL正己烷飽和的乙睛，漩渦混合3 min～5 min，靜置分層，用膠頭吸管將乙睛層轉(zhuǎn)人濃縮瓶?jī)?nèi)。重復(fù)以上操作再用乙睛提取兩次，合并乙睛提取液于錐形瓶?jī)?nèi)。將乙睛提取液在40℃下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，初始流動(dòng)相定容至2 mL，0.22 μm濾膜過濾后備用。

2　結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件

沒食子酸酯類化合物的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1　沒食子酸酯類化合物的結(jié)構(gòu)圖Fig.1　Structure of gallates

如圖1所示，PG、IAG、OG、DG的分子結(jié)構(gòu)中都含有3個(gè)羥基，呈弱酸性，適合在ESI的負(fù)離子模式下形成準(zhǔn)分子離子。以[M-H]-作為母離子，進(jìn)行子離子掃描，確定豐度最高的兩個(gè)子離子作為定性、定量特征離子。對(duì)毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、射頻透鏡電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，4種沒食子酸酯的定量和定性子離子及相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

本文考察了4種沒食子酸酯在純水、甲醇、0.1%甲酸、氫氧化銨（pH8.0）4種溶液作為流動(dòng)相時(shí)的電噴霧電離情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PG、DG、OG、IAG在中性環(huán)境（純水、甲醇）和酸性環(huán)境（0.1%甲酸溶液）中均能電離、且信號(hào)良好，在堿性環(huán)境（氫氧化銨溶液）中信號(hào)最強(qiáng)。

2.2沒食子酸酯的碰撞誘導(dǎo)解離分析

如圖1所示，PG、IAG、OG、DG的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，其苯環(huán)上都含有3個(gè)羥基，在負(fù)離子模式下均失去1 個(gè)H離子生成[M-H]-。以[M-H]-為母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離分析。4種沒食子酸酯都產(chǎn)生了m/z為124.1和169.1的碎片子離子。推測(cè)PG裂解途徑如圖2所示。

圖2沒食子酸丙酯（PG）可能的ESI-MS裂解途徑Fig.2　Proposed fragmentation pathways of propyl gallate in ESI-MS

IAG、OG、DG在質(zhì)譜中的裂解規(guī)律很有可能與PG類似。

2.3色譜條件

由于4種沒食子酸酯的母離子 [M-H]-經(jīng)過碰撞誘導(dǎo)解離后產(chǎn)生的兩個(gè)豐度最高的子離子都為m/z 169.1和m/z124.1，為避免干擾，通過液相色譜將4種沒食子酸酯盡量分離。結(jié)合沒食子酸酯的理化性質(zhì)及其在色譜柱的分配特性，分別選用基于1.7 μm小顆粒填料技術(shù)的ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱和ACQUITY UPLC BHE C18色譜柱對(duì)沒食子酸酯進(jìn)行色譜分離。結(jié)果顯示，優(yōu)化條件下4種沒食子酸酯在AC QUITY UPLC HSS T3色譜柱能獲得更好的色譜分離效果。

試驗(yàn)考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-10 mmol/L甲酸銨溶液、甲醇-氫氧化銨（pH8.0）溶液4種流動(dòng)相在液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)中的分離效果。結(jié)果表明，含有少量酸的流動(dòng)相體系可以使沒食子酸酯在色譜柱上獲得理想的分離效果。綜合考慮沒食子酸酯在4種流動(dòng)相體系中的色譜分離效果和質(zhì)譜檢測(cè)情況，選擇甲醇-0.1%甲酸溶液作為沒食子酸酯液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)的流動(dòng)相。

2.4工作曲線和檢出限

按本試驗(yàn)方法，對(duì)50、100、200、500、1 000 μg/L沒食子酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。以定量離子色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，沒食子酸酯的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線。采用在空白油脂樣品中添加沒食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品的方法，設(shè)定目標(biāo)物質(zhì)定量離子色譜峰的檢出限（LOD）為S/N=3，定量限（LQD）為S/N=10。4種沒食子酸酯的線性方程、檢出限和定量限見表2。

表2　4種沒食子酸酯的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)（R）2、檢出限和定量限Table 2　Linear range，regression equation，correlation coefficient （R2），limits of detection（LODs）and limits of quantification（LOQs）of the 4 gallates

2.5回收率與精密度

為檢驗(yàn)方法的真實(shí)度，采用經(jīng)測(cè)定不含沒食子酸酯的花生油樣品作為空白基質(zhì)進(jìn)行添加回收率和精密度試驗(yàn)，樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液使沒食子酸酯的含量分別為0.20、0.50、0.80 mg/kg，按照1.3制備方法進(jìn)行處理，1.2儀器條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)測(cè)試6次，回收率及精密度結(jié)果見表3。

表3　花生油中4種沒食子酸酯的添加回收率和精密度測(cè)試結(jié)果（n=6）Table 3　Results of recovery and precision for 4 gallates in peanut oil（n=6）

在做標(biāo)準(zhǔn)添加時(shí)，由于甲醇配制的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液與油脂樣品不能完全混溶，可使用丙酮稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液后進(jìn)行添加。空白樣品中添加沒食子酸酯（0.50 mg/kg）獲得的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見圖3。

圖3　空白油脂樣品及加標(biāo)油脂樣品的總離子流色譜圖Fig.3　Total ion current chromatograms of a blank oil sample and an oil sample spiked with 0.50 mg/kg of the standard

2.6樣品測(cè)定

為驗(yàn)證該方法的可靠性，從超市購(gòu)買了10種食用植物油產(chǎn)品（包括大豆油、花生油、菜籽油、葵花籽油、玉米油）進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)作質(zhì)控樣品。結(jié)果顯示，所抽取的樣品中均未檢出沒食子酸酯殘留，質(zhì)控樣品的回收率等指標(biāo)均達(dá)到分析要求。

3　結(jié)論

建立了一種使用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定食用植物油中4種沒食子酸酯的方法。該方法快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為食用植物油中沒食子酸酯的定性與定量分析提供了實(shí)用的技術(shù)手段。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.039

收稿日期：2014-04-18

作者簡(jiǎn)介：董貴軍（1984—），男（漢），助理工程師，本科，研究方向：食品安全檢測(cè)。

*通信作者：?jiǎn)逃律?980—），男（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：食品安全檢測(cè)。

Determination of Gallates in Vegetable Oil by UPLC-MS/MS

DONG Gui-jun，QIAO Yong-sheng*，LI Xing-gen，HAN Zhi-ling，HU Hui，F(xiàn)ENG Yin-jie，CHEN Wei
（Taizhou Institute of Supervision&Testing on Product Quality，Taizhou 225300，Jiangsu，China）

Abstract：A method was established for the determination of gallates in edible vegetable oil based on ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.The oil sample was extracted by hexane-saturated acetonitrile，and the chromatographic separation was performed on an ACQUITY UPLCTM HSS T3 column（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）by gradient elution with 0.1%formic acid solution and methanol as the mobile phase.The analyte was detected by electrospray ionization in negative ion mode-MS/MS in multiple reaction monitoring（MRM）mode.For the four gallates，the limits of detection（LOD）were from 0.02 mg/kg to 0.05 mg/kg and the limits of quantification（LOQ）were from 0.06 mg/kg to 0.15 mg/kg.The average recoveries were ranged from 75.4%to 91.3%at the spiked levels of 0.20，0.50，0.80 mg/kg，with the relative standard deviations（RSDs）were not more than 9.2%.Some edible vegetable oil products from local market were detected by the developed method，and the four gallates were not found.

Key words：ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）；gallates；edible vegetable oil；propyl gallate；isoamyl gallate；octyl gallate；dodecyl gallate