竹根七中白樺脂醇的分離與含量測定

寇智斌，夏曉慧，陸遙，何林林，林奇泗（徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇徐州221004）

竹根七中白樺脂醇的分離與含量測定

寇智斌，夏曉慧，陸遙，何林林，林奇泗*
（徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇徐州221004）

摘要：以植物竹根七根及根莖為原料，從中分離并檢測天然防腐成分。用系統(tǒng)溶劑法從竹根七中分離得到化合物純品，用核磁法測定其結(jié)構(gòu)，用高效液相法測定其含量。所得化合物為白樺脂醇，其含量為（0.28±0.02）mg/g。竹根七中含有天然防腐成分白樺脂醇。

關(guān)鍵詞：竹根七；白樺脂醇；高效液相

天然藥物竹根七（Tupistra chinensis Bak.）為百合科開口箭屬植物，分布于中國陜西、安徽、浙江、江西、福建、臺(tái)灣、四川、云南等地，生于林下陰濕處、溪邊或路旁。竹根七以根狀莖入藥，其味甘、微苦，有小毒，具有清熱解毒，散瘀止痛的功效。常用于治療白喉，風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，腰腿疼；外用治癰癤腫毒[1-2]。竹根七具有多方面藥理活性，其醇提物具有祛痰、抗炎及抑菌作用[3]。經(jīng)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，竹根七提取物在體內(nèi)外試驗(yàn)中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤和抗菌活性[4]。竹根七的抗腫瘤和抗菌活性成分主要是其酸性多糖和總皂苷[5-7]。

本研究組在對(duì)其進(jìn)行活性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，竹根七中總酚酸的抗氧化和抗菌活性最強(qiáng)[8]。本研究組采用系統(tǒng)提取法對(duì)竹根七進(jìn)行成分提取，用核磁及液相方法確定其結(jié)構(gòu)，以期明確其作用機(jī)理和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器

AV-600核磁共振儀：瑞士Bruker公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；ZF-1三用紫外分析儀：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；HZQ-C雙層水浴振蕩器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；Agilent 1260型高效液相色儀：安捷倫Agilent。

1.1.2試劑與藥材

石油醚（60℃～90℃）、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醇：購自科特試劑有限公司；薄層層析硅膠GF254柱層析硅膠（100目～200目）、柱層析硅膠（200目～300目）、Sephadex LH-20、D101大孔樹脂：購自青島海洋化工有限公司。

竹根七藥材（批號(hào)90043）：購自鵬翔藥業(yè)，粉碎并過二號(hào)篩后貯于干燥器備用；對(duì)照品白樺脂醇（批號(hào)130914）：購自四川省維克奇生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1提取與分離

將藥材粗粉5 kg，加入10倍量75%乙醇浸泡過夜，采用中藥提取罐進(jìn)行回流提取，提取3次，提取時(shí)間依次為2、1.5 h和1.5 h，合并濾液，減壓回收溶劑，濃縮后得浸膏，將浸膏用適量水稀釋懸浮后，依次先后用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取5次，合并各萃取液，減壓濃縮后得到4個(gè)萃取層的浸膏。

將乙酸乙酯浸膏用硅膠拌樣后，采用硅膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)不同梯度（100∶0、95∶5、90∶10、85∶15、80∶20，體積比）進(jìn)行洗脫。將洗脫后得到的餾分通過TLC檢查合并相近組分。在氯仿-甲醇（95∶5，體積比）的梯度洗脫出餾分，經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜和凝膠柱色譜分離和純化，得到某白色結(jié)晶。

1.2.2核磁共振測定結(jié)構(gòu)

將1.2.1項(xiàng)下分離得到的白色結(jié)晶進(jìn)行1H NMR spectra和13C NMR核磁分析。所得白色結(jié)晶溶解于吡啶中，在300 MHz下分析，以四甲基硅烷（TMS）為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品計(jì)算各峰的化學(xué)位移δ（mg/L）。

1.2.3HPLC分析

1.2.3.1色譜條件與系統(tǒng)試用性試驗(yàn)

Agilent 1260型高效液相色儀；色譜柱：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ（4.6ID×250 mm）Manf.No.K66428；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸（85∶15，體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：210 nm。按上述色譜條件進(jìn)樣，白樺脂醇與相鄰峰的分離度皆大于1.5，理論板數(shù)按白樺脂酸峰和白樺脂醇峰皆大于3 000。

1.2.3.2供試品溶液的配制

精密稱取干燥的竹根七粗粉5 g，以甲醇為提取溶劑，于索氏提器中水浴恒溫85℃提取3次，每次60min。濾過，合并3次濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將其濃縮近干。將濃縮后樣品用甲醇溶解濾過后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

1.2.3.3對(duì)照品溶液配制

稱取白樺脂醇對(duì)照品適量，用甲醇溶解于50 mL容量瓶中定容至刻度，精密配制濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL白樺脂醇對(duì)照品溶液。

1.2.3.4高效液相色譜分析

取1.2.3.3項(xiàng)下一系列不同濃度的白樺脂醇對(duì)照品溶液按1.2.3.1項(xiàng)下色譜方法分析，計(jì)算回歸方程。再取1.2.3.2項(xiàng)下供試品溶液按1.2.3.1項(xiàng)下色譜方法分析，計(jì)算含量，測定3次，求平均值及RSD值。

2　結(jié)果與討論

2.1結(jié)構(gòu)鑒定

將1.2.1項(xiàng)下分離得到的白色結(jié)晶進(jìn)行核磁氫譜和碳譜的分析，得到結(jié)果如下：白色結(jié)晶，1HNMR（吡啶，300 MHz）0.815（3H，s），0.845（3H，s），1.043（6H，s），1.052（3H，s），1.056（3H，s），1.787（3H，s），3.533（1H，dd，11.4，4.2 Hz），4.754（1H，s），4.964（1H，s）；13CNMR（吡啶，300 MHz），150.245（C-20），109.964（C-29），78.153（C-3），56.655（C-17），51.011（C-9），49.823 （C-19），47.841（C-18），42.883（C-14），41.156（C-8），39.547（C-4），38.692（C-13），37.561（C-10），34.872（C-7），32.931（C-16），28.672（C-23），28.333（C-2），21.234（C-11），19.502（C-30），16.365（C-26）與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致，故確定該化合物為白樺脂醇（Betulin），分子結(jié)構(gòu)見圖1，該化合物為首次從竹根七中分離得到。

圖1　白樺脂醇分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1　Molecular structure of Betulin

2.2樣品含量測定

按1.2.3.3項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣測定。以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y= 6 434.1X+85.25，r=0.999 3。取1.2.3.2項(xiàng)下供試品溶液3份，按1.2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖見圖2。將峰面積代入回歸方程求得竹根七中白樺脂醇平均含量為0.28 mg/g，RSD為1.7%。

3　結(jié)論

白樺脂醇及其衍生物作為生物制劑廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品行業(yè)。其在食品開發(fā)領(lǐng)域可作為一種天然的新型防腐劑用于肉制品的防腐。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以牛肉為原料，使用白樺脂醇作為天然的新型防腐劑可得到貨架期和感官性質(zhì)俱佳的牛肉干產(chǎn)品[10]。白樺脂醇多從白樺樹皮中提取，在其他植物中也有少量存在。然而白樺樹是多年生木本植物，采收其樹皮對(duì)森林植被的破壞較大。如果能夠廣泛的發(fā)掘含有白樺脂醇的天然植物，尤其是生長周期短的草本植物，必將產(chǎn)生的良好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。目前在竹根七中發(fā)現(xiàn)白樺脂醇尚屬首次。竹根七甲醇提取物對(duì)細(xì)菌的抑制作用也印證了其作為天然防腐成分來源的可行性。本研究為天然防腐劑植物來源的擴(kuò)大提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖2　竹根七提取物高效液相色譜圖Fig.2　HPLC chromatograms of the reference substance and extracts from Tupistra chinensis

參考文獻(xiàn)：

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.033

收稿日期：2015-08-31

基金項(xiàng)目：徐州市科技廳2014年立項(xiàng)課題（Xjy201419）

作者簡介：寇智斌（1987—），女（漢），藥師，本科，研究方向：藥物體內(nèi)代謝研究。

*通信作者：林奇泗（1980—），男（漢），副教授，博士，研究方向：中藥活性成分分析與體內(nèi)代謝研究。

Isolation and Determination of Betulin in Tupistra chinensis

KOU Zhi-bin，XIA Xiao-hui，LU Yao，HE Lin-lin，LIN Qi-si*
（College of Pharmacy，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，Jiangsu，China）

Abstract：The natural preservatives composition of roots and rhizomes of Tupistra chinensis was separated and detected.The systematic solvent extraction method was used to isolate active ingredients.Structure of isolated compound was identified by nuclear magnetic，and its content was determined by HPLC.The isolated compound was identified as Betulin，and its content was（0.28±0.02）mg/g.Betulin which is a kind of natural ingredient exists in Tupistra chinensis.

Key words：Tupistra chinensis；Betulin；HPLC