• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    表面活化甲殼素固定化Gibberella intermedia 生物轉(zhuǎn)化制備 異煙酸

    2015-07-25 03:36:20龔勁松李恒楊濤錢建瑛陸震鳴許正宏史勁松
    化工進展 2015年10期
    關(guān)鍵詞:三聚磷酸鈉氰基水解酶

    龔勁松,李恒,楊濤,錢建瑛,陸震鳴,許正宏,史勁松

    (江南大學藥學院,江蘇 無錫 214122)

    我國甲殼素生物質(zhì)資源儲量豐富,來源廣泛,是僅次于纖維素的第二大高分子物質(zhì),每年僅蝦蟹殼等生物質(zhì)廢棄物來源的甲殼素就高達1000 多萬噸[1-3]。甲殼素在土壤中被微生物降解后,可改善土壤中微生物群落結(jié)構(gòu),促進植物生長,因此可作為一種潛在的土壤改良劑[4];甲殼素作為飼料添加劑也具有一定的市場前景,已獲得美國FDA 批準;另外,甲殼素還具有較強的抗菌作用,因此可用于水果及肉制品的保鮮;由于安全無毒,甲殼素及其衍生物還可用于食品行業(yè)中的增稠劑和食品添加 劑[5]。但甲殼素的分子具有非常穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu),分子間和分子內(nèi)存在較強的氫鍵作用,使得甲殼素形成高度的結(jié)晶結(jié)構(gòu),使其溶解性能差,不易溶于水、稀酸稀堿和常規(guī)的有機溶劑中[1,3],嚴重限制了它的發(fā)展與應(yīng)用。

    據(jù)不完全統(tǒng)計,目前我國90%以上甲殼素用于酸水解制造氨糖,但氨糖不屬于我國的原料藥,因此80%以上產(chǎn)品主要出口至國外。然而,國際市場氨糖價格降低至10 萬元/噸以下,同時隨著合成生物學的發(fā)展,目前國內(nèi)氨糖已可通過生物法進行大規(guī)模生產(chǎn),而且生物法價格低廉,導(dǎo)致氨糖價格持續(xù)走低;另外,隨著環(huán)保問題日益受到重視,環(huán)境污染治理成本提高,很多廠家開始減少生產(chǎn)。未來甲殼素加工將面臨新一輪的難題,必須尋找新的突破。將甲殼素進行低成本利用、建立一種綠色工藝,不僅有利于將廢棄資源變廢為寶、對環(huán)境友好,而且具有潛在的經(jīng)濟效益和良好的研究價值。

    對甲殼素進行修飾、改性,將極大的拓展甲殼素的應(yīng)用范圍;而對甲殼素表面進行脫乙?;罨瞧渲凶钪匾姆绞街弧=?jīng)表面脫乙酰修飾的甲殼素可溶于稀酸,具有良好的吸附性和通透性等優(yōu)點,同時還保留了甲殼素的結(jié)構(gòu)框架,因此具備了更加廣闊的應(yīng)用前景。

    腈水解酶是工業(yè)生物催化中的一種關(guān)鍵酶類,可一步催化腈類化合物生成有機酸及氨基酸等,該反應(yīng)條件溫和、催化效率高、綠色環(huán)保,從而在化工、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用[6-7]。然而,從已有文獻資料來看,腈水解酶的實際應(yīng)用仍受到穩(wěn)定性不夠高、催化劑的重復(fù)利用批次較差等因素的限制;由于具有改善穩(wěn)定性、提高重復(fù)利用率、緩解細胞自身裂解等優(yōu)勢,固定化技術(shù)的出現(xiàn)可彌補上述腈水解酶應(yīng)用中的缺陷[8-10]。另外,傳統(tǒng)研究主要采用細菌來源的腈水解酶為催化劑,而有關(guān)真菌腈水解酶則相對研究較少,而且據(jù)文獻報道,真菌腈水解酶在選擇性和底物譜等方面相比細菌腈水解酶具有一定優(yōu)勢[11]。

    本工作嘗試采用經(jīng)表面活化的甲殼素廢棄物用于固定產(chǎn)腈水解酶的真菌Gibberella intermedia,進行4-氰基吡啶的生物轉(zhuǎn)化以制備異煙酸。近年來有關(guān)修飾改性甲殼素的研究主要集中于其對重金屬和有毒有害化合物的吸附功能[3,12-13],而采用表面活化改性的甲殼素固定產(chǎn)酶細胞則鮮有研究,利用該固定化腈水解酶催化劑制備有機酸尚屬首次報道。

    1 實驗部分

    1.1 儀器和試劑

    立式離心機,日本HITACHI 公司;UV-2100紫外分光光度計,上海UNICO 儀器有限公司;高壓滅菌鍋,日本三洋公司;DK-8D 型電熱恒溫水槽,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,鞏義市予華儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱,上海博訊醫(yī)療儀器有限公司;甲殼素制備原料由揚州日興生物科技股份有限公司提供;4-氰基吡啶、異煙酸和異煙酰胺為分析純,購自阿拉丁試劑公司;酵母粉和胰蛋白胨,由Oxoid 公司生產(chǎn);其他化學試劑均為分析純。

    1.2 菌種培養(yǎng)

    產(chǎn)腈水解酶真菌G. intermedia 由本實驗室篩選獲得[14],已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCC No. 4903。將斜面上的菌種接種至種子培養(yǎng)基,30℃、200r/min條件下培養(yǎng)36h;再將新鮮的種子轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、200r/min 培養(yǎng)60h。離心收集菌體 備用。

    種子培養(yǎng)基(g/L):蔗糖30,硝酸鈉3,磷酸氫二鉀1,硫酸鎂0.5,氯化鉀0.5,硫酸亞鐵0.01;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,酵母粉7.5,磷酸二氫鉀2.72,硫酸亞鐵0.014,氯化鈉1.16,己內(nèi)酰胺3.39,pH 值 7.0。

    1.3 表面活化甲殼素制備

    將蛋白酶處理過的蝦殼用水洗滌3 次、過濾、烘干備用;采用4%的鹽酸對預(yù)處理樣品進行脫鈣處理,隨后將樣品洗滌至中性;在微波(高火)條件下,采用40%氫氧化鈉溶液對其進行脫乙酰,微波處理時間30min,此時脫乙酰度達到約80%,隨后水洗至中性,收集濾渣108℃烘干至恒重;用密封式粉碎機將樣品粉碎成60~150 目左右細粉 備用。

    1.4 固定化細胞制備

    收集培養(yǎng)獲得的絮狀菌體制成菌懸液,將用2%乙酸溶液溶解的表面活化甲殼素,與一定濃度的菌液均勻混合。利用帶有針頭的醫(yī)用注射器穩(wěn)定地將混合液滴入到不同濃度的三聚磷酸鈉溶液中固化成球。在4℃條件下固化4h。采用pH 值7.0 的磷酸鈉緩沖液(10mmol/L)洗滌固定化細胞至中性后分別測定酶活,在確定最優(yōu)的甲殼素濃度、三聚磷酸鈉濃度及菌體濃度后,優(yōu)化固定化時間。

    1.5 固定化細胞的生物轉(zhuǎn)化

    以4-氰基吡啶為底物,固定化細胞為催化劑,進行固定化和游離細胞合成異煙酸的生物轉(zhuǎn)化過程研究。將反應(yīng)體系中各組分分別置于30℃下溫浴10min 后轉(zhuǎn)入錐形瓶中,轉(zhuǎn)化反應(yīng)在30℃旋轉(zhuǎn)式搖床上進行,用2mol/L HCl 終止反應(yīng),取一定量轉(zhuǎn)化液進行酶活檢測。該腈化合物轉(zhuǎn)化過程中,產(chǎn)物酸與氨是1∶1 生成。一個酶活單位的定義為:在測定條件下,1min 時間內(nèi)轉(zhuǎn)化生成1μmol 氨所對應(yīng)的酶量為1U。

    1.6 檢測方法

    氨含量檢測方法:采用苯酚-次氯酸鈉法[15]。根據(jù)堿性條件下亞硝基鐵氰化鈉可催化氨與苯酚和次氯酸鈉反應(yīng)生成藍色可溶性物質(zhì)的特點,通過紫外分光光度法測定該藍色物質(zhì)。在反應(yīng)液中依次加入苯酚鈉溶液2.0mL、亞硝基鐵氰化鈉和次氯酸鈉溶液各3.0mL,用除氨水定容至10mL,充分搖勻后置于27℃水浴中反應(yīng)15min,取出后于630nm 處測定其吸收值。

    底物及產(chǎn)物的HPLC 檢測方法:色譜柱為Atlantis dC 18 柱,5.0μm,150mm×4.6mm;流動相為甲醇/0.01%磷酸(體積比5∶95);波長268nm;柱溫30℃;流速0.7mL/min。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 固定化過程各因素對細胞酶活的影響

    2.1.1 甲殼素濃度對固定化細胞酶活的影響

    當經(jīng)表面活化的甲殼素濃度(質(zhì)量分數(shù),下同)為3%時比酶活達到最高,提高或降低濃度均導(dǎo)致比酶活降低[圖1(a)]??赡苡捎诩讱に氐氖褂脻舛仍礁?,其分子沉淀形成的固化膜越致密,且固化速度過快容易出現(xiàn)拖尾,底物分子進出細胞難度增加,故酶活降低;另一方面,當甲殼素濃度過低時它與凝結(jié)劑三聚磷酸鈉的接觸無法形成穩(wěn)定的固化膜,不能得到高質(zhì)量、高機械強度的固定化細胞。

    圖1 甲殼素濃度、三聚磷酸鈉濃度、固定化時間和菌體濃度對固定化細胞酶活的影響

    2.1.2 三聚磷酸鈉濃度對酶活的影響

    三聚磷酸鈉濃度影響凝結(jié)液的pH 值和陰離子濃度,從而影響固定化小球的形成速度和穩(wěn)定性。在低濃度三聚磷酸鈉溶液中,固定化小球生成速度慢,所制得小球機械強度差,易變形、破碎;不過隨著三聚磷酸鈉濃度提高,小球生成速度加快,產(chǎn)品機械強度和穩(wěn)定性提高。但三聚磷酸鈉濃度過高則會導(dǎo)致小球生成速度過快,不能形成完全的孔膜,小球呈橢圓形,有氣孔,機械強度差。由圖1(b)可知,三聚磷酸鈉質(zhì)量分數(shù)由4%升高到7%時,固定化細胞的比酶活逐漸提高,三聚磷酸鈉質(zhì)量分數(shù)提升至12%時,比酶活則開始逐漸降低。最終選擇7%三聚磷酸鈉為固定化細胞的最適凝結(jié)劑濃度。

    2.1.3 固定時間對酶活的影響

    固定時間對固定化細胞酶活的影響如圖1(c)所示。固化時間太短,所形成的固化膜結(jié)構(gòu)松散,固定化小球機械強度差,細胞逃逸量較大。當固化時間為5h 時,凝膠網(wǎng)絡(luò)具有較高的機械強度,固化膜致密程度適中,固定化細胞具有最大酶活。因此選擇固定化細胞的最佳固定時間為5h。

    2.1.4 菌體包埋量的選擇

    催化劑在固定化細胞體系中的含量將直接影響其催化反應(yīng)速率。如圖1(d)所示,在所采用的細胞濃度由6g/L 提高至20g/L 的范圍內(nèi),隨細胞濃度增加酶活也相應(yīng)提高。但當菌體濃度從20g/L 增加到24g/L 時,比酶活卻隨著菌體加入量的增加而減小,出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能歸于活細胞間對營養(yǎng)物質(zhì)的相互競爭所造成的[16]。故綜合考慮,將該體系的菌體濃度確立為20g/L。

    2.2 固定化細胞轉(zhuǎn)化過程各因素對細胞酶活的 影響

    2.2.1 溫度對酶活的影響

    采用上述條件制備的固定化細胞用于4-氰基吡啶的生物轉(zhuǎn)化。首先考察了溫度對固定化細胞酶活力的影響。一般溫度的影響主要分兩方面:在一定范圍內(nèi)隨著溫度的升高,酶活力提高;但當溫度繼續(xù)升高酶則逐漸變性失活,反應(yīng)速率下降。

    圖2(a)為溫度對甲殼素固定化細胞酶活的影響。結(jié)果顯示固定化細胞的最適反應(yīng)溫度為50℃;而實驗室前期研究已發(fā)現(xiàn)相應(yīng)游離細胞最適反應(yīng)溫度為40℃[14]。隨著反應(yīng)溫度升高,酶促反應(yīng)速率加快,但酶蛋白也會失活變性,使得酶活力降低。

    2.2.2 轉(zhuǎn)化pH 值對酶活的影響

    圖2 轉(zhuǎn)化溫度和pH 值對固定化細胞酶活的影響

    微生物酶均在一定的pH 值條件下才顯示出最佳反應(yīng)活性,當高于或低于此pH 值時酶活都會受影響而活力降低。酶活力受pH 值變化影響的原因是,當pH 值發(fā)生微小偏移,酶活性部位的基團離 子發(fā)生變化而導(dǎo)致酶活降低;pH 值發(fā)生較大偏移的時候,會導(dǎo)致酶蛋白的變性。目前,生物催化反應(yīng)多數(shù)在中性環(huán)境中進行,在此條件下催化反應(yīng)速率一般能達到最大值。如圖2(b)所示,固定化細胞的最適反應(yīng)pH 值為7.0;游離細胞的最適反應(yīng)pH 值為7.6[14],基本保持穩(wěn)定。固定化細胞酶活隨pH值變化趨勢較緩,說明甲殼素固定化對細胞有一定的保護作用。本實驗室前期還嘗試過采用殼聚糖-聚乙烯醇復(fù)合材料進行G.intermedia固定化,結(jié)果表明固定化細胞最適反應(yīng)溫度和pH 值分別為45℃和7.0[17]。與本實驗結(jié)果基本一致。

    2.2.3 底物濃度對酶活的影響

    底物濃度能夠顯著影響底物轉(zhuǎn)化速率和細胞酶活力,尤其對于腈化合物這類對細胞有毒性的底物。在酶濃度恒定條件下,當?shù)孜餄舛容^小時,酶未被底物飽和,這時反應(yīng)速率取決于底物濃度;隨著底物濃度增加,中間復(fù)合物生成也越多,而反應(yīng)速率取決于中間復(fù)合物的濃度,故反應(yīng)速率也隨之增高。當溶液中的酶全部被底物飽和,溶液中無多余的酶,盡管提高底物濃度也不會再有更多的中間復(fù)合物生成,這時反應(yīng)速率達到最大。但當?shù)孜餄舛冗^高時會對酶產(chǎn)生抑制作用。

    實驗結(jié)果表明[圖3(a)],固定化細胞轉(zhuǎn)化選取底物濃度為125mmol/L 時酶活最高,當?shù)孜餄舛仍?25~200mmol/L 時,酶活雖有所降低,但降低幅度較緩慢。而游離細胞在低于50mmol/L 底物濃度時具有較高酶活,當濃度高于50mmol/L,游離細胞的酶活受到抑制,而200mmol/L 底物甚至使游離細胞酶活幾乎喪失[14]??梢钥闯黾讱に氐墓潭▽w具有保護作用,使催化劑的底物耐受性有顯著提高。G. intermedia 復(fù)合固定化細胞的最適轉(zhuǎn)化底物濃度為300mmol/L[17],相比甲殼素固定化細胞有進一步提高。因此后續(xù)研究將繼續(xù)摸索該固定化工藝以期進一步改善甲殼素固定化細胞的催化潛力。

    圖3 底物濃度和產(chǎn)物濃度對固定化細胞酶活的影響

    2.2.4 產(chǎn)物濃度對酶活的影響

    產(chǎn)物酸的高濃度及所造成的pH 值環(huán)境對于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進一步進行具有一定抑制作用。因此本研究考察了產(chǎn)物異煙酸的濃度對酶活的影響,分別選取50~600mmol/L 產(chǎn)物濃度進行實驗。由圖3(b)可知,固定化細胞在產(chǎn)物濃度小于400mmol/L 時,酶活基本保持穩(wěn)定,且有小幅度提升。而游離細胞在高于150mmol/L 濃度時酶活則快速降低。這可能歸因于在固定化細胞中,產(chǎn)物濃度增加后,細胞的通透性增強,促進了底物和產(chǎn)物的擴散,使酶催化速率提升。雖然產(chǎn)物對酶有抑制作用,但細胞的通透性增強的效果略大于產(chǎn)物對酶的抑制效應(yīng),所以酶活也有一定上升。但當產(chǎn)物濃度繼續(xù)增大時,抑制作用增強,酶迅速失活。

    2.2.5 重復(fù)利用批次對底物轉(zhuǎn)化率的影響

    在以上優(yōu)化的最適條件下,以125mmol/L 4-氰基吡啶為底物,比較固定化細胞和游離細胞對底物4-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化過程。如圖4(a)所示,游離細胞和固定化細胞分別在100min 和80min 內(nèi)將底物轉(zhuǎn)化完全,并生成相應(yīng)的異煙酸,同時反應(yīng)體系中會檢測到微量的異煙酰胺同時生成。在此基礎(chǔ)上,進行批次轉(zhuǎn)化實驗。如圖4(b)所示,固定化細胞可以重復(fù)利用14 個批次,菌體轉(zhuǎn)化能力為45.5g(4-氰基吡啶)/g(dcw);而游離細胞可重復(fù)利用3 個批次,菌體轉(zhuǎn)化能力為9.75g(4-氰基吡啶)/g(dcw)。這充分證明固定化細胞具有良好的穩(wěn)定性。不過在轉(zhuǎn)化后期,固定化小球不斷吸水膨脹,會出現(xiàn)少部分破碎。

    圖4 4-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化過程及批次轉(zhuǎn)化

    3 結(jié) 論

    異煙酸是合成抗結(jié)核病藥物的重要中間體,在醫(yī)藥化工等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。傳統(tǒng)研究主要采用化學方法進行合成;由于具備反應(yīng)條件溫和、催化特異性高等特點,采用腈水解酶介導(dǎo)的生物催化合成途徑近年來逐步受到重視。但目前已報道的對4-氰基吡啶具有高特異性的產(chǎn)腈水解酶菌株仍非常有限,而且主要集中于細菌來源的菌株。本研究采用實驗室前期篩選獲得的一株對4-氰基吡啶轉(zhuǎn)化效率較高的真菌G. intermedia 為催化劑,首次嘗試通過表面活化的甲殼素為包埋材料對游離細胞進行固定化,優(yōu)化了固定化過程的基本參數(shù),并將制備的固定化細胞應(yīng)用于4-氰基吡啶生物轉(zhuǎn)化合成異煙酸。甲殼素及其衍生物主要來源于蝦蟹等海產(chǎn)品的外殼,來源豐富、而且具有生物安全性,本研究針對廢棄生物質(zhì)資源高效利用,拓展了工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中生物質(zhì)的資源化領(lǐng)域,并為異煙酸的規(guī)?;锖铣傻於嘶A(chǔ);具有良好的經(jīng)濟價值和理論意義。

    [1] 蔣小姝,莫海濤,蘇海佳,等. 甲殼素及殼聚糖在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域方面的應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)學通報,2013,29(6):170-174.

    [2] 張群. 甲殼生物質(zhì)資源生態(tài)高值加工關(guān)鍵技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 食品與生物技術(shù)學報,2014,33(3):336.

    [3] Huang C-M,Chen L-C,Yang H-C,et al. Preparation of acrylic acid-modified chitin improved by an experimental design and its application in absorbing toxic organic compounds[J]. J. Hazard Mater.,2012,241-242:190-196.

    [4] 趙云強,方伊. 甲殼素、殼聚糖的綜合應(yīng)用及其發(fā)展前景[J]. 貴州化工,2001,26(1):10-13.

    [5] 蘇廣宇,劉四新,李從發(fā). 甲殼素/殼聚糖的研究與應(yīng)用概況[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學,2008,2:107-111.

    [6] Gong J-S,Lu Z-M,Li H,et al. Nitrilases in nitrile biocatalysis:Recent progress and forthcoming research[J]. Microb. Cell Fact.,2012,11:142.

    [7] Martínková L,K?en V. Biotransformations with nitrilases[J]. Curr. Opin. Chem. Biol.,2010,14(2):130-137.

    [8] Ni K,Wang H,Zhao L,et al. Efficient production of(R)-(-)-mandelic acid in biphasic system by immobilized recombinant E. coli[J]. J. Biotechnol.,2013,167(4):433-440.

    [9] Pawar S,Meena V,Kaushik S,et al. Stereo-selective conversion of mandelonitrile to(R)-(-)-mandelic acid using immobilized cells of recombinant Escherichia coli[J]. 3 Biotech.,2012,2:319-326.

    [10] Gong J-S,Lu Z-M,Li H,et al. Metagenomic technology and genome mining:Emerging areas for exploring novel nitrilases[J]. Appl. Microbiol. Biotechnol.,2013,97(15):6603-6611.

    [11] Vejvoda V,Kubác D,Davidová A,et al. Purification and characterization of nitrilase from Fusarium solani IMI196840[J]. Process Biochem.,2010,45(7):1115-1120.

    [12] Kousalya G N,Gandhi M R,Meenakshi S. Preparation of modified chitin for the removal of chromium(Ⅵ)[J]. Bioremediat. J.,2010,14(4):208-218.

    [13] Yong S K,Bolan N S,Lombi E,et al. Sulfur-containing chitin and chitosan derivatives as trace metal adsorbents:A review[J]. Crit. Rev. Env. Sci. Technol.,2012,43(16):1741-1794.

    [14] Wu Y,Gong J-S,Lu Z-M,et al. Isolation and characterization of Gibberella intermedia CA3-1,a novel and versatile nitrilase- producing fungus[J]. J. Basic Microbiol.,2013,53(11):934-941.

    [15] Gong J-S,Lu Z-M,Shi J-S,et al. Isolation,identification,and culture optimization of a novel glycinonitrile - hydrolyzing fungus—— Fusarium oxysporum H3[J]. Appl. Biochem. Biotechnol.,2011,165(3):963-977.

    [16] Hegge AB,Andersen T,Melvik JE,et al. Formulation and bacterial phototoxicity of curcumin loaded alginate foams for wound treatment applications:Studies on curcumin and curcuminoides XLII[J]. J. Pharm. Sci.,2011,100(1):174-185.

    [17] 楊濤,李恒,龔勁松,等. 固定化Gibberella intermedia 轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶制備煙酸[J]. 化工進展,2014,33(9):2432-2437.

    猜你喜歡
    三聚磷酸鈉氰基水解酶
    無底物情況下來白Rhoclococcus zopfii的腈水解酶中親核進攻試劑CYS165的活性狀態(tài)的探究(英文)
    取代基對氰基官能化苯并噁嗪樹脂固化反應(yīng)及熱穩(wěn)定性的影響
    腈水解酶反應(yīng)機制與催化性能調(diào)控研究進展
    氨基甲酸乙酯水解酶的家族生物信息學分析
    生物信息學(2022年1期)2022-04-01 08:56:50
    氰基硼氫化鈉還原胺化京尼平合成擬生物堿與活性
    三種不同膠水熏顯手印的比較
    超低Ⅰ型三聚磷酸鈉制備工藝研究
    神奇水解酶?!俺浴彼芰?/a>
    三聚磷酸鈉對混凝土性能影響的研究
    河南建材(2017年2期)2017-04-26 01:32:54
    羰基還原酶不對稱還原?-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯
    久久香蕉精品热| 精品一区二区三区视频在线观看免费| www.自偷自拍.com| 精品乱码久久久久久99久播| 国产黄色小视频在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 日韩国内少妇激情av| 欧美日韩精品网址| 男人舔奶头视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 日本熟妇午夜| 日本 av在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 成熟少妇高潮喷水视频| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲精品一区av在线观看| 国产一区二区激情短视频| 成年人黄色毛片网站| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美激情久久久久久爽电影| 搡老岳熟女国产| 天天添夜夜摸| 少妇的丰满在线观看| 欧美日本视频| 一级a爱片免费观看的视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲国产欧美网| 日韩免费av在线播放| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美乱妇无乱码| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品一区二区免费欧美| 日本黄色视频三级网站网址| 老汉色av国产亚洲站长工具| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 可以在线观看毛片的网站| 不卡一级毛片| 欧美性猛交黑人性爽| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲专区国产一区二区| 五月玫瑰六月丁香| 欧美日韩一级在线毛片| 在线国产一区二区在线| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲,欧美精品.| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 久久精品91蜜桃| 在线免费观看的www视频| 国产成人影院久久av| 正在播放国产对白刺激| 老汉色∧v一级毛片| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 无人区码免费观看不卡| 不卡av一区二区三区| 美女大奶头视频| or卡值多少钱| 露出奶头的视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| x7x7x7水蜜桃| 久久热在线av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| av欧美777| 国产亚洲欧美在线一区二区| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲av电影不卡..在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 91九色精品人成在线观看| 久久香蕉精品热| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 日韩三级视频一区二区三区| 最近最新免费中文字幕在线| 成年免费大片在线观看| 免费av毛片视频| 丝袜美腿诱惑在线| 国产成人av教育| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产精品久久久久久久电影 | 黄色片一级片一级黄色片| 欧美一级a爱片免费观看看 | 给我免费播放毛片高清在线观看| 日韩欧美在线二视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品国产高清国产av| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 99国产综合亚洲精品| 很黄的视频免费| 久久 成人 亚洲| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 99久久精品热视频| 日韩av在线大香蕉| 在线观看日韩欧美| 一级毛片女人18水好多| 757午夜福利合集在线观看| 丁香欧美五月| 久久中文字幕人妻熟女| 日韩高清综合在线| 亚洲国产中文字幕在线视频| 9191精品国产免费久久| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 99在线人妻在线中文字幕| 国产成人精品久久二区二区91| 三级毛片av免费| 日本三级黄在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 97碰自拍视频| 1024香蕉在线观看| а√天堂www在线а√下载| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产成人av激情在线播放| av天堂在线播放| 国产精品,欧美在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 757午夜福利合集在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 色哟哟哟哟哟哟| 婷婷精品国产亚洲av在线| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 午夜福利免费观看在线| 黄片大片在线免费观看| e午夜精品久久久久久久| 国产精品电影一区二区三区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产99白浆流出| 国产不卡一卡二| 国产精品精品国产色婷婷| 久久久国产成人精品二区| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 老司机福利观看| 在线a可以看的网站| 五月玫瑰六月丁香| 婷婷丁香在线五月| 一级黄色大片毛片| 国产精品av久久久久免费| 欧美成人免费av一区二区三区| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲九九香蕉| 精品第一国产精品| 日韩欧美精品v在线| 夜夜爽天天搞| 黄色a级毛片大全视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产一区二区在线观看日韩 | 在线视频色国产色| 香蕉国产在线看| 91九色精品人成在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 午夜精品在线福利| 岛国在线观看网站| 亚洲中文av在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 小说图片视频综合网站| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲男人的天堂狠狠| 日本黄色视频三级网站网址| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 99久久精品热视频| e午夜精品久久久久久久| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 最近最新中文字幕大全电影3| 999久久久国产精品视频| 51午夜福利影视在线观看| xxx96com| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 麻豆国产av国片精品| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 99在线人妻在线中文字幕| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 午夜两性在线视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| xxx96com| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国内精品久久久久久久电影| 日韩中文字幕欧美一区二区| 制服丝袜大香蕉在线| 日韩欧美国产在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| www.www免费av| 9191精品国产免费久久| 久久天堂一区二区三区四区| 国产成人欧美在线观看| 国产精品久久久久久久电影 | 麻豆国产97在线/欧美 | 美女大奶头视频| 毛片女人毛片| 成人国产综合亚洲| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲avbb在线观看| 好男人电影高清在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 一级作爱视频免费观看| 亚洲专区国产一区二区| 精品免费久久久久久久清纯| avwww免费| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 亚洲精品在线观看二区| 最近在线观看免费完整版| 少妇熟女aⅴ在线视频| 天堂√8在线中文| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久久久久九九精品二区国产 | 悠悠久久av| 成人午夜高清在线视频| netflix在线观看网站| 一进一出好大好爽视频| 中出人妻视频一区二区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 91国产中文字幕| 无限看片的www在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 久久久久精品国产欧美久久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美成狂野欧美在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲熟妇熟女久久| 两个人看的免费小视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 黄频高清免费视频| 色综合婷婷激情| 91麻豆精品激情在线观看国产| x7x7x7水蜜桃| 不卡一级毛片| 又大又爽又粗| 不卡av一区二区三区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产高清视频在线播放一区| 免费搜索国产男女视频| 天天一区二区日本电影三级| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产激情久久老熟女| 男人舔奶头视频| 男插女下体视频免费在线播放| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲av日韩精品久久久久久密| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 嫩草影视91久久| 啪啪无遮挡十八禁网站| 特级一级黄色大片| 变态另类丝袜制服| 中文在线观看免费www的网站 | 久久久国产成人精品二区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 两个人视频免费观看高清| 一级毛片精品| 在线免费观看的www视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 99精品久久久久人妻精品| 国产精品1区2区在线观看.| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美高清成人免费视频www| 免费电影在线观看免费观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲欧美激情综合另类| 两个人的视频大全免费| 国产av又大| av福利片在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产探花在线观看一区二区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 正在播放国产对白刺激| 国产免费av片在线观看野外av| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 波多野结衣高清无吗| 毛片女人毛片| 日本黄色视频三级网站网址| 日本 欧美在线| 超碰成人久久| 国产一区二区激情短视频| 男女那种视频在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| e午夜精品久久久久久久| 欧美一区二区精品小视频在线| 日本 欧美在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 午夜福利免费观看在线| 中文字幕av在线有码专区| 国产欧美日韩一区二区三| 免费在线观看成人毛片| 不卡一级毛片| 男人的好看免费观看在线视频 | av福利片在线| 久久久久久免费高清国产稀缺| 最近最新免费中文字幕在线| 国产乱人伦免费视频| 制服丝袜大香蕉在线| 中文字幕av在线有码专区| 深夜精品福利| svipshipincom国产片| 精华霜和精华液先用哪个| av片东京热男人的天堂| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产视频内射| 午夜影院日韩av| 久久午夜亚洲精品久久| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 中国美女看黄片| 欧美不卡视频在线免费观看 | 全区人妻精品视频| 国产精品 国内视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲国产欧美网| 国产精品九九99| 日本一本二区三区精品| 日韩欧美三级三区| 久久人妻av系列| 亚洲激情在线av| 亚洲avbb在线观看| 久久这里只有精品中国| 久久伊人香网站| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲人成伊人成综合网2020| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美日韩福利视频一区二区| 男人舔女人的私密视频| 99在线视频只有这里精品首页| 在线观看www视频免费| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美日韩精品网址| 69av精品久久久久久| 国产免费男女视频| 搡老妇女老女人老熟妇| www日本在线高清视频| 久久中文字幕一级| 日韩国内少妇激情av| 91av网站免费观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲欧美精品综合久久99| 午夜福利18| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 在线视频色国产色| 欧美另类亚洲清纯唯美| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日本 av在线| 欧美成人免费av一区二区三区| 在线视频色国产色| 午夜福利成人在线免费观看| av在线播放免费不卡| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美av亚洲av综合av国产av| 人妻久久中文字幕网| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产单亲对白刺激| 欧美在线黄色| 久9热在线精品视频| 午夜激情av网站| 最近最新中文字幕大全免费视频| 手机成人av网站| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲最大成人中文| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美不卡视频在线免费观看 | 两个人的视频大全免费| bbb黄色大片| 999久久久国产精品视频| 一进一出抽搐动态| 午夜福利在线在线| 欧美中文日本在线观看视频| 啦啦啦免费观看视频1| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲成人久久性| 极品教师在线免费播放| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲av熟女| 精品国产乱子伦一区二区三区| 精品人妻1区二区| 18美女黄网站色大片免费观看| 成人一区二区视频在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 看免费av毛片| 舔av片在线| 国产熟女xx| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲七黄色美女视频| 757午夜福利合集在线观看| 大型av网站在线播放| 成年版毛片免费区| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美三级亚洲精品| 真人一进一出gif抽搐免费| 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧美日韩一级在线毛片| av中文乱码字幕在线| e午夜精品久久久久久久| 色在线成人网| 99久久综合精品五月天人人| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 级片在线观看| 免费高清视频大片| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 久久久久精品国产欧美久久久| 美女黄网站色视频| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品爽爽va在线观看网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 一夜夜www| 成人国产综合亚洲| 免费看十八禁软件| 日韩欧美 国产精品| 女警被强在线播放| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 欧美午夜高清在线| 成人欧美大片| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美日韩精品网址| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 18禁观看日本| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品av视频在线免费观看| cao死你这个sao货| 国产视频一区二区在线看| 欧美色视频一区免费| 波多野结衣高清无吗| 狂野欧美激情性xxxx| av欧美777| 九色国产91popny在线| 床上黄色一级片| 亚洲av片天天在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国语自产精品视频在线第100页| 日韩高清综合在线| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美中文日本在线观看视频| 香蕉av资源在线| 淫妇啪啪啪对白视频| 90打野战视频偷拍视频| 婷婷亚洲欧美| 成人手机av| 伊人久久大香线蕉亚洲五| www国产在线视频色| 99久久精品热视频| 成人欧美大片| а√天堂www在线а√下载| 一级黄色大片毛片| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 少妇人妻一区二区三区视频| 中文在线观看免费www的网站 | 高清在线国产一区| 美女午夜性视频免费| 精品一区二区三区四区五区乱码| 12—13女人毛片做爰片一| 男女视频在线观看网站免费 | 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美黑人欧美精品刺激| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 91字幕亚洲| 国产男靠女视频免费网站| 美女 人体艺术 gogo| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 麻豆av在线久日| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日本a在线网址| 白带黄色成豆腐渣| 日韩大码丰满熟妇| 欧美三级亚洲精品| 久久九九热精品免费| 我的老师免费观看完整版| 好男人在线观看高清免费视频| av福利片在线观看| 我要搜黄色片| 黑人操中国人逼视频| 久久精品影院6| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲av美国av| 91大片在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产一区在线观看成人免费| 精品久久蜜臀av无| 国产成人系列免费观看| 欧美黄色淫秽网站| 国产成人系列免费观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美av亚洲av综合av国产av| www国产在线视频色| 搡老岳熟女国产| 欧美极品一区二区三区四区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 校园春色视频在线观看| 亚洲片人在线观看| 天堂影院成人在线观看| 成在线人永久免费视频| 午夜两性在线视频| 最新在线观看一区二区三区| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产成人精品久久二区二区免费| 夜夜爽天天搞| www.自偷自拍.com| 高清在线国产一区| 中文字幕熟女人妻在线| 麻豆成人av在线观看| x7x7x7水蜜桃| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲av成人一区二区三| 99riav亚洲国产免费| 国产av在哪里看| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久久久久大精品| 久热爱精品视频在线9| x7x7x7水蜜桃| 宅男免费午夜| 无限看片的www在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 怎么达到女性高潮| 69av精品久久久久久| ponron亚洲| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 白带黄色成豆腐渣| 美女 人体艺术 gogo| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲成av人片在线播放无| 丝袜人妻中文字幕| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲av成人精品一区久久| 男女之事视频高清在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 色av中文字幕| 视频区欧美日本亚洲| 在线观看66精品国产| 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久中文看片网| 国产午夜精品论理片| 久久午夜亚洲精品久久| 国产不卡一卡二| 波多野结衣巨乳人妻| 免费看十八禁软件| 亚洲成人精品中文字幕电影| 一级毛片女人18水好多| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲全国av大片| 国产精品永久免费网站| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美三级亚洲精品| 色av中文字幕| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲熟女毛片儿| 国产单亲对白刺激| 久久香蕉国产精品| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 女警被强在线播放| 国产私拍福利视频在线观看| 超碰成人久久| 可以在线观看的亚洲视频| 丰满的人妻完整版| 一本大道久久a久久精品| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久这里只有精品中国| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品欧美国产一区二区三| 国内揄拍国产精品人妻在线| 9191精品国产免费久久| 一本一本综合久久| 国产不卡一卡二| 欧美高清成人免费视频www| 给我免费播放毛片高清在线观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 真人做人爱边吃奶动态| 嫁个100分男人电影在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日韩大码丰满熟妇| 啦啦啦免费观看视频1| 国产成人精品久久二区二区免费| 91国产中文字幕| 一区福利在线观看| 香蕉久久夜色| 在线观看日韩欧美| 精品欧美国产一区二区三| 国产野战对白在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品久久视频播放| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产精品电影一区二区三区| 久久久久国内视频| 国产在线观看jvid| 久久久久久久久中文| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久婷婷成人综合色麻豆| aaaaa片日本免费|