輔酶Q10對1-甲基-4-苯基吡啶帕金森病大鼠的干預(yù)作用及其機(jī)制研究

高俊鵬，周子懿，向 軍，陳依萍，羅恩麗，蔡定芳

同行評議:

諸多研究提示輔酶Q10(CoQ10)可以對帕金森病 (PD)動物模型起到神經(jīng)保護(hù)作用，然而，最近的多中心隨機(jī)雙盲臨床試驗(yàn)卻未能得出陽性結(jié)果。為揭示這一現(xiàn)象的可能原因，本研究分別采用CoQ10預(yù)防性與治療性給藥的方式對1-甲基-4-苯基吡啶 (MPP+)-PD大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果提示，CoQ10預(yù)防性給藥可以改善PD大鼠的運(yùn)動功能，減少多巴胺神經(jīng)元的死亡，而CoQ10治療性給藥則無效。由此提出了CoQ10應(yīng)在PD病程早期給藥，對于PD發(fā)病高危人群則應(yīng)預(yù)防性給藥的新觀點(diǎn)。本研究結(jié)果從給藥時間窗角度解釋了CoQ10在臨床研究中未能得到陽性結(jié)果的原因，同時對后續(xù)臨床研究與應(yīng)用起到一定指引作用。

帕金森病 (Parkinson's disease，PD)是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理特征為黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)神經(jīng)元進(jìn)行性變性?，F(xiàn)有治療方法雖然可以部分緩解患者的癥狀，但仍無有效方法阻止DA神經(jīng)元的變性過程。線粒體酶復(fù)合體Ⅰ (ComplexⅠ)活性的降低是導(dǎo)致PD發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。在對PD患者和PD模型的研究中，均發(fā)現(xiàn)ComplexⅠ功能的下降［1］，線粒體膜及線粒體DNA受到破壞，致使能量合成障礙，大量自由基生成，損傷DA神經(jīng)元［2］。

輔酶Q10(CoQ10)是線粒體電子傳遞鏈重要組分之一，在ATP生成以及減少自由基的產(chǎn)生方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。因而，補(bǔ)充外源性CoQ10可能是PD治療策略之一。動物研究發(fā)現(xiàn)，口服CoQ10能夠?qū)Χ喾NPD模型產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用［3-4］。薈萃分析亦顯示，CoQ10對PD有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用［5］。然而Cornell大學(xué)領(lǐng)銜PD研究團(tuán)隊隨后開展了更高劑量CoQ10治療早期PD患者的多中心、隨機(jī)、雙盲Ⅲ期臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示，不論是1 200 mg/d或2 400 mg/d的CoQ10，均未能給患者帶來益處［6］。這可能是因?yàn)镻D患者癥狀明顯時，其黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)DA神經(jīng)元已經(jīng)減少了60%～80%所致。因此，筆者提出了CoQ10應(yīng)提早給藥的觀點(diǎn)。本研究擬利用1-甲基-4-苯基吡啶 (MPP+)-PD大鼠模型，觀察CoQ10預(yù)防性用藥與治療性用藥對PD模型大鼠的干預(yù)效果，并從線粒體功能的角度探討其可能的機(jī)制，以期為CoQ10治療PD的用藥時間窗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及分組 選取清潔級標(biāo)準(zhǔn)健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，體質(zhì)量250～280 g。由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，并飼養(yǎng)于該實(shí)驗(yàn)動物中心，自由進(jìn)食、飲水。動物房12 h/12 h光暗交替，平均溫度22℃，相對濕度30%。按照國際實(shí)驗(yàn)動物使用準(zhǔn)則［7］對動物進(jìn)行操作，以減少實(shí)驗(yàn)動物在實(shí)驗(yàn)過程中的痛苦。采用完全隨機(jī)設(shè)計將大鼠均分為4組，假手術(shù)組、模型組、CoQ10預(yù)防性給藥組、CoQ10治療性給藥組，各12只。

1.2 試劑與藥品 MPP+(Sigma公司，D048)，阿樸嗎啡 (Sigma公司，A4393)，CoQ10(上海信宜制藥廠有限公司)、10%驢血清 (Sigma，D9663)，抗酪氨酸羥化酶 (TH)抗體 (Sigma公司，T8700)，抗OX-42抗體 (Chemicon公司，CBL1512)，磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.3 方法

1.3.1 建立MPP+-PD大鼠模型及假手術(shù)組處理方法 大鼠予苯巴比妥麻醉，緩慢將2 μl MPP+(10 μg)以0.4 μl/min速度通過鼠腦立體定位儀注射入左側(cè)黑質(zhì)致密部。注射完畢待大鼠清醒后將大鼠置動物房繼續(xù)飼養(yǎng)，2周后以阿樸嗎啡0.25 mg/kg作為行為學(xué)鑒定，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)，誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)，計數(shù)注藥1 h大鼠右側(cè)凈旋轉(zhuǎn)數(shù)，＞300轉(zhuǎn)為造模成功。假手術(shù)組以等量0.9%氯化鈉溶液代替MPP+，其余步驟同上。

1.3.2 給藥方法 CoQ10以飼料混合方式給藥［8］，將CoQ10與大鼠全價營養(yǎng)飼料混合，制備成CoQ10含量為0.2%的飼料，取代大鼠全價營養(yǎng)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。CoQ10預(yù)防性給藥組大鼠在造模前第9天開始給予含CoQ10飼料，造模后次日改回全價營養(yǎng)飼料，即連續(xù)給予CoQ10飲食10 d。CoQ10治療性給藥組大鼠在造模后次日開始給予CoQ10飼料，連續(xù)給予10 d。

1.3.3 行為學(xué)評價 阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)、前肢跨步運(yùn)動試驗(yàn)、觸須引發(fā)不對稱放置試驗(yàn)是評定偏側(cè)PD大鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)損害程度的常用行為學(xué)指標(biāo)［9-10］，前肢跨步運(yùn)動試驗(yàn)、觸須引發(fā)不對稱放置試驗(yàn)得分越高表示運(yùn)動功能損害越嚴(yán)重。本研究分別于造模第0、1、3、7、14、21天時評價各組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)并進(jìn)行比較。

1.3.3.1 阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn) 在各觀察時間點(diǎn)皮下注射阿樸嗎啡，劑量為0.3 mg/kg，誘發(fā)其旋轉(zhuǎn)行為，旋轉(zhuǎn)360°為一轉(zhuǎn)，記錄大鼠30 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)數(shù)。

1.3.3.2 前肢跨步運(yùn)動試驗(yàn) 握住大鼠軀干，用手指固定并抬起一側(cè)前肢，同時輕微提起大鼠軀干的后半部，使另一側(cè)前肢著地，產(chǎn)生跨步運(yùn)動，每側(cè)肢體檢測10 s，兩側(cè)輪換。計算損傷同側(cè)不對稱指數(shù) (損傷同側(cè)跨步次數(shù)/損傷同側(cè)對側(cè)次數(shù)和-損傷對側(cè)跨步次數(shù)/損傷同側(cè)對側(cè)次數(shù)和)。

1.3.3.3 觸須引發(fā)不對稱放置試驗(yàn) 握住大鼠軀干并離開地面，將其一側(cè)觸須觸碰桌角。當(dāng)大鼠一側(cè)觸須觸碰桌角時可誘發(fā)同側(cè)前肢向桌角的放置動作，受損前肢常不能將前肢成功放置于桌角。評分時，兩側(cè)前肢分別試驗(yàn)10次，計算不成功放置的比例 (損傷對側(cè)前肢不成功放置次數(shù)/損傷同側(cè)前肢不成功放置次數(shù))×10。

1.4 免疫熒光組化染色與定量分析

1.4.1 組織切片 大鼠在烏拉坦深度麻醉下，利用4%多聚甲醛灌注固定取腦，按常規(guī)方法用冷凍切片機(jī)做大腦冠狀面連續(xù)切片，漂片備用。

1.4.2 TH與小膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)補(bǔ)體 C3受體(OX-42)免疫熒光組化染色 以TH標(biāo)記DA神經(jīng)元，OX-42標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞。染色方法如下:(1)從漂片器皿中挑取腦薄片，每只大鼠挑取6張。(2)PBS漂洗后，用10%驢血清封閉，4℃過夜。 (3)一抗:兔抗TH或鼠抗OX-42抗體，4℃孵育40 h。(4)PBS漂洗3次，10 min/次。 (5)二抗:羅丹明偶聯(lián)的驢抗兔IgG，避光室溫下孵育90 min。(6)PBS漂洗3次，10 min/次，避光。(7)封片后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4.3 免疫熒光組化染色結(jié)果的觀察與分析 經(jīng)免疫熒光組化染色處理后的切片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，使用10倍和40倍物鏡。用Leica Qwin 500圖像分析軟件對黑質(zhì)區(qū)域進(jìn)行觀察，測定OX-42免疫熒光強(qiáng)度，結(jié)果以平均光密度值表示。計算DA神經(jīng)元存活率，以MPP+注射同側(cè)TH陽性神經(jīng)元數(shù)量與對側(cè)的比值表示。

1.4.4 ComplexⅠ活性的測定 參考文獻(xiàn) ［8］取中腦組織，將線粒體蛋白于測定前置于20℃/-20℃反復(fù)凍融3次，使之成為線粒體膜片段以進(jìn)行線粒體呼吸鏈ComplexⅠ活性測定。將10 μg線粒體蛋白加入到ComplexⅠ反應(yīng)緩沖液中 (KCl 110 mmol/L，KH2PO45 mmol/L，MgCl21 mmol/L，Tris-HCl 20 mmol/L，NaN33 mmol/L，抗毒素 A 1 mg/L，CoQ1060 μmol/L)混勻，37℃孵育3 min加入30～50 μg線粒體蛋白啟動反應(yīng)，1 min內(nèi)連續(xù)測定A340值的變化，根據(jù)1 min A340值的變化反映ComplexⅠ的活性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布計量資料以 (±s)表示，4組免疫熒光組化染色結(jié)果和ComplexⅠ活性的比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn);4組不同時間行為學(xué)得分比較采用兩變量雙因素重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組大鼠不同時間行為學(xué)得分比較 4組大鼠不同時間點(diǎn)阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)轉(zhuǎn)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F交互=22.299，P＜ 0.01;F時間=132.494，P＜0.01;F組間=99.994，P＜0.01，見圖1A);4 組大鼠不同時間點(diǎn)前肢跨步運(yùn)動試驗(yàn)得分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F交互=10.622，P＜ 0.01;F時間=107.880，P＜0.01;F組間=45.621，P＜0.01，見圖 1B);4 組大鼠不同時間點(diǎn)觸須引發(fā)不對稱放置試驗(yàn)得分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F交互=8.281，P＜0.05;F時間=120.000，P＜0.01;F組間=40.200，P＜0.01，見圖1C)。

2.2 4 組大鼠OX-42免疫熒光強(qiáng)度和DA神經(jīng)元存活率比較 在假手術(shù)組大鼠中腦黑質(zhì)部位，OX-42免疫熒光強(qiáng)度較低。在MPP+造模后第21天，紅色標(biāo)記DA神經(jīng)元的特異抗體，用綠色標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞的特異抗體OX-42。在模型組大鼠中腦黑質(zhì)部位，OX-42免疫熒光組化染色較深，免疫熒光強(qiáng)度較高 (見圖2)。4組OX-42免疫熒光強(qiáng)度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=7.460，P＜0.01);模型組、CoQ10預(yù)防性給藥組、CoQ10治療性給藥組OX-42免疫熒光強(qiáng)度高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01，見圖3)。4組DA神經(jīng)元存活率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=229.757，P＜0.01)。CoQ10預(yù)防性給藥組大鼠DA神經(jīng)元存活率高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (q=9.136，P＜0.01，見圖4)。

2.3 4 組大鼠ComplexⅠ活性比較 假手術(shù)組、模型組、CoQ10預(yù)防性給藥組、CoQ10治療性給藥組大鼠的ComplexⅠ活性分別為 (174.3 ± 27.2)、 (93.5 ±17.0)、(151.3 ±21.9)、(116.2 ±19.6)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=16.395，P＜ 0.01)。CoQ10預(yù) 防 性 給 藥 組 大 鼠ComplexⅠ活性高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (q=6.507，P＜0.01);而CoQ10治療性給藥組大鼠與模型組ComplexⅠ活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (q=2.550，P＞0.05)。

3 討論

近年來，PD的早期治療正受到越來越多的關(guān)注［11］。對該病10年的臨床觀察表明，第1年統(tǒng)一PD評分量表 (UPDRS)評分上升尤為迅速，而后9年則維持相對穩(wěn)定［12］。病理結(jié)果顯示，相對于晚期PD而言，早期患者黑質(zhì)致密部DA神經(jīng)元的死亡速度表現(xiàn)為非完全線性急劇上升［13］，均提示PD早期病情發(fā)展較快。因此，在PD病程的早期甚至臨床前期進(jìn)行積極的神經(jīng)保護(hù)治療顯得尤為必要。

PD患者DA神經(jīng)元線粒體中CoQ10含量顯著低于正常人，有學(xué)者認(rèn)為CoQ10異?？赡苁腔颊呔€粒體障礙的原因，CoQ10作為線粒體中的重要輔酶，在線粒體呼吸鏈中起傳遞質(zhì)子及電子的作用，是重要的天然抗氧化劑和特異性免疫增強(qiáng)劑［14］。外源性CoQ10通過保護(hù)線粒體膜和嵴，保持線粒體結(jié)構(gòu)完整而維持其氧化磷酸化功能減少自由基生成，并抑制磷脂酶A2對細(xì)胞膜磷脂的分散，對生物膜起保護(hù)和穩(wěn)定作用。

圖1 4組大鼠不同時間行為學(xué)得分比較Figure 1 Comparison of behavioral performance among the four groups

圖2 4組大鼠OX-42免疫熒光強(qiáng)度和DA神經(jīng)元免疫熒光組化染色結(jié)果Figure 2 Immunohistochemicalphotomicrographs showing OX-42 immunointensity and DA neurons among the four groups

圖3 各組OX-42免疫熒光強(qiáng)度比較Figure 3 Comparison of the immunofluorescence intensity of OX-42 in each group

圖4 各組DA神經(jīng)元存活率比較Figure 4 Comparison of the survial ratio of DA neurons in each group

在本研究中，CoQ10預(yù)防性給藥組大鼠各時間點(diǎn)行為學(xué)表現(xiàn)優(yōu)于模型組，CoQ10預(yù)防性給藥組OX-42免疫熒光強(qiáng)度高于假手術(shù)組，CoQ10預(yù)防性給藥組大鼠DA神經(jīng)元存活率高于模型組，提示CoQ10預(yù)防性給藥能減輕PD大鼠行為學(xué)異常，提高DA神經(jīng)元存活率。本研究還發(fā)現(xiàn)，CoQ10預(yù)防性給藥組大鼠ComplexⅠ活性高于模型組，提示CoQ10預(yù)防性給藥可使線粒體ComplexⅠ的活性增高，造模后給藥則無此作用。其原因可能為線粒體ComplexⅠ功能的改善需要一個長期過程，需在CoQ10作用數(shù)天后才能完成。若CoQ10在MPP+注射后開始給藥，那么在ComplexⅠ功能增強(qiáng)之前，DA神經(jīng)元就已經(jīng)因線粒體功能的下降而變性死亡，因此無法起到對DA神經(jīng)元保護(hù)和行為學(xué)改善效果。

本研究對預(yù)防性與治療性給予線粒體功能增強(qiáng)劑CoQ10的效果進(jìn)行比較，結(jié)果提示，CoQ10預(yù)防性給藥可以通過阻止PD大鼠線粒體ComplexⅠ活性的下降，延緩DA神經(jīng)元衰退過程，減慢PD癥狀進(jìn)行性發(fā)展的速度，進(jìn)一步印證了PD病程早期干預(yù)的重要性。臨床上，對于PD發(fā)病高危人群，如長期暴露于魚藤酮等農(nóng)藥或曾接觸1-甲基 -4-苯基 -1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)等毒素，尤其有PD家族史的人群，筆者認(rèn)為預(yù)防性服用CoQ10可能延緩PD的發(fā)病過程。

本研究也存在一定局限性。目前認(rèn)為，PD的發(fā)病機(jī)制包括線粒體功能異常、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等［15］。本研究僅從線粒體角度探討了CoQ10的可能機(jī)制，未能涵蓋其他PD發(fā)病機(jī)制。后續(xù)研究可以針對多種發(fā)病機(jī)制對PD模型進(jìn)行聯(lián)合給藥，以期探索出更為優(yōu)化的治療策略。

綜上所述，以線粒體ComplexⅠ為靶點(diǎn)預(yù)防性給予CoQ10進(jìn)行干預(yù)可以改善PD模型的運(yùn)動功能，減少DA神經(jīng)元的死亡。對于PD患者而言，在其發(fā)病初期盡早給予CoQ10可能是其取得療效的關(guān)鍵，這就為后續(xù)線粒體功能增強(qiáng)劑的臨床研究提供了新的理論依據(jù)。

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