殼寡糖對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制與誘導(dǎo)凋亡

韓紹芳，周艷芬，2，倪志華，2，武金霞，2，王振山，2

（1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.河北省生物工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071002）

殼寡糖（chitooligosaccharide，COS）是由殼聚糖（chitosan）經(jīng)水解處理后得到的一種低聚糖.因其分子質(zhì)量較低，水溶性好，易被生物體吸收和降解，因此，在生物體內(nèi)具有多種生物學(xué)活性.研究報(bào)道，COS能夠調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)［1－6］，增強(qiáng)機(jī)體免疫力［4，7－9］，促進(jìn)骨折愈合［10］，抗疲勞并增加運(yùn)動(dòng)的耐受力［11－13］，降血糖［14］及抗腫瘤作用［15］等.殼寡糖的制備方法包括物理降解法、化學(xué)降解法以及酶降解法等.這些制備方法通常得到的殼寡糖分子質(zhì)量大小不一，因此很難確定殼寡糖的生物學(xué)功能并進(jìn)一步被開發(fā)利用.本研究采用金屬配位氧化法降解殼聚糖對(duì)得到的產(chǎn)物進(jìn)一步采用732型陽(yáng)離子交換樹脂去除金屬離子并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到的COS聚合度為4，經(jīng)檢測(cè)其能夠有效誘導(dǎo)人肺腺癌細(xì)胞A549凋亡［16］，且對(duì)人腎上皮細(xì)胞293T無明顯抑制作用.為了進(jìn)一步明確自制的COS對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及作用機(jī)制，本研究以Hela細(xì)胞為材料，經(jīng)COS處理后，對(duì)細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，明確COS對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用和對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，為COS的抗腫瘤作用及其開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)支持.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼寡糖，本室自制［16］；二甲基亞砜（DMSO），Solarbio公司；Hela細(xì)胞，河北省腫瘤醫(yī)院科研中心；3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、Wright's－Giemsa染液，Gibco公司；吖啶橙－溴乙錠（AOEB）試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；HRP－羊抗兔、HRP－兔抗鼠補(bǔ)體C3（C3）抗體、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑，Invitrogen公司；兔抗人Bcl－2、鼠單抗Bax、兔抗人Survivin，Santa Cruz公司；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V（AnnexinV－FITC）凋亡檢測(cè)試劑盒，武漢博士德生物工程公司.

CSANVAC冷凍干燥機(jī)，Gene公司；M 680 酶標(biāo)儀，Bio－Rad 公司；倒置顯微鏡CKX41、熒光顯微鏡BX53，Olympus公司；流式細(xì)胞儀FC500，Beckman Coulter公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%的新生胎牛血清、100 U／mL 青霉素、100 U／mL 鏈霉素的DMEM（dulbecco's modified eagle medium）高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d換液傳代培養(yǎng).

1.2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞的增值抑制率

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且臺(tái)盼藍(lán)拒染率大于95%的Hela細(xì)胞，2 000r／min離心10 min，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液將沉淀細(xì)胞濃度調(diào)為1×105／mL 細(xì)胞懸液，每孔加細(xì)胞懸液100μL（1×104個(gè)細(xì)胞）接種于96孔培養(yǎng)板，于37 ℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁后吸出培養(yǎng)液，分別加入質(zhì)量濃度為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，10.0mg／mL的COS和不含COS的培養(yǎng)液各200μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，調(diào)零孔不加含有Hela細(xì)胞的培養(yǎng)液200μL.混勻后分別繼續(xù)培養(yǎng)12h和24h，向各孔中加入20μL MTT（質(zhì)量濃度為5.0 mg／mL），相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入DMSO 150μL，震蕩10min，使形成的甲臜顆粒充分溶解后，于酶標(biāo)儀490nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值（A 值），按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：

細(xì)胞增殖抑制率＝（1－A實(shí)驗(yàn)組／A對(duì)照組）×100%.

1.2.3 Wright's－Giemsa染色觀察細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的EDTA）消化并計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104／mL，加入到盛有蓋玻片的6 孔板中，補(bǔ)足2 mL 的完全培養(yǎng)液，每孔加入約1×105個(gè)細(xì)胞，置于37 ℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)后，吸去培養(yǎng)液，用PBS 洗3次，每次2min，實(shí)驗(yàn)組更換含有5.0mg／mL COS的培養(yǎng)液，陰性對(duì)照組加入不含COS的培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h 后，再次用PBS 洗滌3 次，每次2 min，體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇固定10min，Wright's－Giemsa染色20min，顯微鏡下觀察.

1.2.4 AO－EB染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)

按1.2.3方法處理細(xì)胞并爬片，分別用PBS洗3次，加入AO／EB 染色液2mL（1mL PBS含有20μL的AO／EB），染色5min，吸出染液，PBS洗3次，立即將各組Hela細(xì)胞爬片置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，并拍照.

1.2.5 Annexin V－FITC／PI雙染法定量分析細(xì)胞的凋亡率

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5×105／mL 的密度接種于25mL培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞過夜貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入含有質(zhì)量濃度為5.0mg／mL的COS培養(yǎng)液3mL，對(duì)照組加入不含COS的等量完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后.按照AnnexinV－FITC及PI試劑盒操作步驟，用不含EDTA 的胰酶消化收集，2 000r／min，離心5min.用冷PBS 洗滌細(xì)胞2次（2 000r／min，5min）.超純水1:4稀釋結(jié)合緩沖液，以稀釋的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106／mL.取195μL 細(xì)胞懸液，加入5μL AnnexinV－FITC 混勻，4 ℃避光條件下孵育15min，PBS洗細(xì)胞1次，再以190μL稀釋的結(jié)合緩沖液重懸，加入10μL PI輕輕混勻于4 ℃避光條件下孵育5min，立即上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，光源為488nm 氬離子激光器，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光，PI發(fā)紅色熒光.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞凋亡率.

1.2.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

按1.2.3方法處理細(xì)胞并爬片，加入體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛（PFA）室溫固定30 min.用體積分?jǐn)?shù)0.5% Triton X－100孵育20min，勿洗，直接用5mg／mL 的牛血清白蛋白（BSA）37 ℃封閉30min，分別加入稀釋倍數(shù)為1:400的Bax，Bcl－2，Survivin－抗1mL，4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，每次2min.然后分別加入稀釋倍數(shù)為1:400的HRP－羊抗鼠抗體和HRP－兔抗鼠補(bǔ)體C3（C3）抗體1mL，37 ℃避光孵育1h，PBS洗3次，每次2min.DAB顯色8min，10μg／mL蘇木素復(fù)染5min，顯微鏡下觀察.

1.2.7 免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果評(píng)估

陽(yáng)性細(xì)胞產(chǎn)物染色呈黃色至棕黃色，主要定位于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi).采用雙盲法隨機(jī)選擇5個(gè)典型視野，每個(gè)視野內(nèi)隨機(jī)計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率（A）及陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度（B）進(jìn)行免疫組化評(píng)分［13，17］.陽(yáng)性細(xì)胞百分率A 分為5個(gè)等級(jí)：0～1%為0分，2%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，81%～100%為4分；陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度B 分為4個(gè)等級(jí)：0分為陰性，1分為弱陽(yáng)性，2分為陽(yáng)性，3分為強(qiáng)陽(yáng)性，免疫組化最后得分（IHS）：每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞著色細(xì)胞百分率與著色程度相乘得分即為該視野的最后得分（IHS＝A×B）.每張片子5個(gè)視野的平均分值為該標(biāo)本的最后染色分值，將最后平均染色分值小于1者記為染色陰性標(biāo)本，大于1者記為染色陽(yáng)性標(biāo)本.

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 殼寡糖對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用

與陰性對(duì)照組相比較，COS處理組細(xì)胞12h和24h后，在1.0 ～5.0 mg／mL 內(nèi)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)、質(zhì)量濃度的升高，COS對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制率逐漸增強(qiáng)，且呈量效和時(shí)效的依賴關(guān)系，當(dāng)質(zhì)量濃度為5.0mg／mL并作用24h時(shí)，COS對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到52.15%（P＜0.01），且差異顯著（表1），COS質(zhì)量濃度在6.0，7.0，10.0mg／mL時(shí)，處理12h 和24h后，Hela細(xì)胞增殖抑制率均有所下降，且抑制水平相當(dāng).因此，本研究選用COS質(zhì)量濃度為5.0mg／mL處理24h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

表1 COS對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用Tab.1 Effect of inhibiting proliferation by COS on Hela cell

2.2 殼寡糖對(duì)Hela細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響

COS處理細(xì)胞24h后，經(jīng)Wright's－Giemsa染色觀察，對(duì)照組細(xì)胞膜完整，核仁及染色質(zhì)分布在細(xì)胞核中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為細(xì)胞貼壁能力減弱、細(xì)胞質(zhì)萎縮、體積變小、部分呈現(xiàn)圓形、出現(xiàn)凋亡小體（圖1）.

圖1 Wright's－Giemsa染色結(jié)果Fig.1 Results of Wright's－Giemsa staining

經(jīng)AO－EB染色，熒光顯微鏡下觀察（圖2），對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，核著色均勻，為綠色熒光，實(shí)驗(yàn)組觀察到部分核染色質(zhì)固縮狀和圓珠狀，為早期凋亡細(xì)胞，部分核染色質(zhì)出現(xiàn)橘紅色，為晚期凋亡細(xì)胞.這些結(jié)果表明，經(jīng)COS處理的Hela細(xì)胞在形態(tài)上出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡，說明COS能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡.

圖2 AO－EB染色結(jié)果Fig.2 Results of AO－EB staining

2.3 殼寡糖誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡率的定量分析

COS處理細(xì)胞經(jīng)AnnexinV－FITC／PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其凋亡率及壞死率（圖3）.圖中左下象限（LL）代表活細(xì)胞量（FITC－／PI－），左上象限（UL）代表細(xì)胞處理過程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞（FITC－／PI＋），右下象限（LR）代表早期凋亡細(xì)胞（FITC＋／PI－），右上象限（UR）代表晚期凋亡細(xì)胞（FITC＋／PI＋）.對(duì)照組與COS組相應(yīng)的各象限細(xì)胞存活狀態(tài)見表2.經(jīng)COS 處理后的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為31.75%，壞死率為18.79%，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

圖3 AnnexinV－FITC／PI雙染結(jié)果Fig.3 Results of AnnexinV－FITC／PI duble staining

表2 AnnexinV－FITC／PI雙染細(xì)胞存活狀態(tài)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistics of AnnexinV－FITC／PI double staining of cell survival state

2.4 殼寡糖對(duì)Hela細(xì)胞中Bax，Bcl－2，Survivin表達(dá)量的影響

細(xì)胞爬片經(jīng)COS處理后，分別檢測(cè)Bax，Bcl－2，Survivin蛋白表達(dá)量（圖4），與對(duì)照組相比，COS組的Bax蛋白細(xì)胞質(zhì)著色增強(qiáng)，表明Hela經(jīng)COS處理后細(xì)胞質(zhì)中Bax表達(dá)量增加；Bcl－2蛋白與Survivin蛋白COS組細(xì)胞質(zhì)著色程度較對(duì)照組明顯減輕，表明Hela細(xì)胞經(jīng)COS處理后細(xì)胞質(zhì)中Bcl－2，Survivin表達(dá)量均降低.按1.2.7方法對(duì)免疫組化得分進(jìn)行評(píng)估（表3），COS組的Bax IHS值明顯高于對(duì)照組，Bcl－2，Survivin IHS值明顯低于對(duì)照組，說明經(jīng)COS處理后Hela細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)量明顯上調(diào)，而Bcl－2和Survivin表達(dá)量明顯下調(diào).

表3 陽(yáng)性細(xì)胞記數(shù)及免疫組織化學(xué)評(píng)分（5個(gè)視野）Tab.3 Positive cell count and immunohistochemistry score（five horizons）

圖4 COS處理Hela細(xì)胞后對(duì)Bax，Bcl－2，Survivin表達(dá)量的影響Fig.4 Impact on Bax，Bcl－2，Survivin expression of Hela cells after COS treatment

3 討論

COS是由2～10個(gè)氨基葡萄糖或N－乙酰氨基葡萄糖經(jīng)β－1，4糖苷鍵連接而成的線性寡糖，基于其優(yōu)良的生物學(xué)特征，近年來被人們廣泛關(guān)注.已有研究證實(shí)，COS能夠誘導(dǎo)白血病HL－60細(xì)胞［18］、結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞［15］凋亡，能夠抑制腎腫瘤細(xì)胞OS－RC－2［19］、肝癌SMMC－7721細(xì)胞［20－21］，S180肉瘤細(xì)胞［22］、膀胱癌細(xì)胞［23］的增殖并且促進(jìn)其凋亡等.本實(shí)驗(yàn)采用金屬配位氧化法制備的平均聚合度為4的COS作用于Hela細(xì)胞，通過MTT 法，確定5.0mg／mL的COS作用24h，對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到52.15%.作者進(jìn)一步采用Wright's－Giemsa染色、AO－EB染色觀察COS處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的變化，結(jié)果表明，COS組細(xì)胞產(chǎn)生了凋亡現(xiàn)象，如細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核固縮，變圓，出現(xiàn)凋亡小體，AO－EB 染色出現(xiàn)早期和晚期凋亡細(xì)胞.采用流式細(xì)胞技術(shù)定量分析COS誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡率為31.75%，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，自制的COS可抑制Hela細(xì)胞增殖并且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

細(xì)胞凋亡是一種主動(dòng)的程序性死亡，涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等.在細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的研究中，Bcl－2蛋白家族備受關(guān)注.按其對(duì)凋亡正、負(fù)調(diào)控作用，可將Bcl－2家族成員分為兩類：一類為凋亡促進(jìn)蛋白，如Bax，Bcl－xs，Bad等；另一類為凋亡抑制蛋白，如Bcl－2和Bcl－x2，Bcl－xl等［22］.Bcl－2為重要的抗凋亡蛋白，對(duì)細(xì)胞凋亡擔(dān)負(fù)著重要的作用［24－25］.Bax可以與Bcl－2形成異源二聚體，從而阻止Bcl－2的抗凋亡作用［26］.Survivin是近來發(fā)現(xiàn)的IAP家族新成員［27］.研究表明，Survivin是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子［28］，其可直接作用于效應(yīng)蛋白caspase－3和caspase－7，也可通過P21間接抑制caspase［29］，從而阻斷細(xì)胞的凋亡過程.誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療腫瘤的一種手段.本研究采用免疫組織化學(xué)法，發(fā)現(xiàn)自制的COS處理Hela細(xì)胞后Bax表達(dá)量上調(diào)，Bcl－2和Survivin表達(dá)量下調(diào)，表明COS對(duì)Hela細(xì)胞作用是通過抑制抗凋亡蛋白Bcl－2的表達(dá)，抑制caspase家族的抑制劑Survivin蛋白的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，為COS抗腫瘤作用機(jī)制及其開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)支持.

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