蔓越莓抑制UVB誘導HaCaT細胞氧化損傷和凋亡的研究

劉碩，鄺夢婷，朱華偉，林勇，*（.湖南農業(yè)大學國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南長沙408；.無限極（中國）有限公司，廣東廣州5063）

蔓越莓抑制UVB誘導HaCaT細胞氧化損傷和凋亡的研究

劉碩2，鄺夢婷1，朱華偉2，林勇1，*
（1.湖南農業(yè)大學國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南長沙410128；2.無限極（中國）有限公司，廣東廣州510623）

摘要：研究蔓越莓對中波紫外線（UVB）誘導的人表皮角質形成細胞（HaCaT）光損傷的保護作用。用3個不同劑量的蔓越莓果汁預處理HaCaT細胞6 h，采用60m J/cm2強度UVB照射細胞；然后用MTT法檢測細胞的生存率，吸取細胞上清液采用比色法檢測丙二醛（MDA）、羥脯氨酸（Hyp）的含量和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、乳酸脫氫酶（LDH）的活性變化，用熒光法檢測細胞內活性氧自由基（ROS）含量，用倒置顯微鏡和流式細胞儀觀察檢測細胞凋亡狀況。UVB輻射對HaCaT細胞造成比較嚴重的損傷；相比于空白對照組，UVB輻射模型組HaCaT細胞活性下降了29.54%，SOD和GSH-Px活性極顯著降低（P<0.01）；相比于模型組，蔓越莓各劑量組可顯著提高UVB照射后HaCaT細胞的活力（P<0.05或P<0.01），提高SOD和GSH-Px活性（P<0.01），減少MDA和ROS含量（P<0.05或P<0.01），并且降低LDH活性和增加Hyp含量（P<0.01），呈劑量依賴關系，從而降低UVB所導致的細胞損傷及凋亡率升高。蔓越莓可以明顯減少UVB誘導HaCaT細胞的氧化損傷和凋亡，具有顯著的光保護功效，其作用機制與增強細胞抗氧化能力、加速清除氧自由基以及促進膠原蛋白合成有關。

關鍵詞：蔓越莓；HaCaT細胞；中波紫外線（UVB）；氧化損傷；凋亡；抑制作用

皮膚光老化是皮膚外源性老化的一個重要組成，長期紫外線輻射是環(huán)境中促使皮膚老化的最重要因素[1]。紫外線輻射可誘導皮膚細胞產生大量高活性自由基，能破壞皮膚的抗氧化系統(tǒng)，從而使自身抗氧化酶活性降低并導致脂質過氧化物堆積[2-3]。同時過量高活性自由基亦能導致DNA氧化損傷，進而造成DNA鏈斷裂和堿基氧化，從而誘導細胞凋亡甚至誘發(fā)皮膚癌變等疾病[3]。在紫外線輻射中，對人體皮膚產生影響的主要是長波紫外線（ultraviolet radiation A，UVA，320 nm～400 nm）和中波紫外線（ultraviolet radiation B，UVB，280 nm～320 nm），而且相同劑量UVB的生物學效應大約是UVA的800倍～1000倍[4]。已有大量研究表明，UVB是造成皮膚光老化的最主要因素[5]，也是皮膚癌發(fā)生的重要因素[6]，使用UVB照射建?？烧T導動物皮膚光老化[7]。為了減輕UVB輻射對皮膚細胞的光損傷，應用抗氧化劑已是人們保護皮膚的有效措施[8-9]。蔓越莓（Cranberry）是越桔屬植物，素有“北美紅寶石”之稱，在我國的大興安嶺地區(qū)也比較常見[10]；2007年美國衛(wèi)生部對常食用水果的抗氧化能力進行評估，蔓越莓高居榜首[11]。蔓越莓的超強抗氧化能力可能與其含有豐富的黃酮類、香豆素、酚類以及萜類等天然活性物質有關[12]，從而造就了其延緩衰老、抗感染、抗腫瘤、防治消化系統(tǒng)疾病、保護口腔和牙齒等多種特殊功能[13]。尤其蔓越莓中富含的原花青素（一種生物類黃酮），是國際上公認的清除人體自由基最有效的天然抗氧化劑，其抗氧化能力達到VE的50倍[13]。當前關于蔓越莓保健及藥理功效的研究國外主要集中在抗感染、抗氧化、抗癌等方面，國內文獻報道很少[14]。因此，國內開展關于我國蔓越莓資源的功效研究很少，特別是關于蔓越莓對UVB光損傷的人表皮角質形成細胞（HaCaT）的保護作用未見報道?；诖耍狙芯客ㄟ^UVB誘導HaCaT細胞氧化損傷，建立體外光老化細胞模型，觀察蔓越莓對UVB導致HaCaT細胞氧化損傷和凋亡的影響并探討相關抗光老化機理，旨在為我國蔓越莓資源利用以及新型抗皮膚光老化產品開發(fā)提供科學依據(jù)和科技支撐。

1　材料與方法

1.1細胞和蔓越莓果汁凍干粉

HaCaT細胞株（人永生化表皮角質形成細胞）：由武漢大學典型物保藏中心提供；蔓越莓果汁凍干粉：由無限極（中國）有限公司提供。

1.2儀器與試劑

SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；CO2培養(yǎng)箱：美國Nuaire公司；UVP紫外交聯(lián)儀：美國思博明科學器材公司；DMIL-LED倒置顯微鏡：德國Leica公司；Varioskan Flash多功能酶標儀：美國Thermo公司；FACsort流式細胞儀：美國BD公司；UV-2501紫外分光光度計：日本Shimadzu公司；MH-1微型振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Rotina離心機：德國Hettich公司；AEU-210電子天平：長沙湘儀天平儀器公司。

MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶：購自美國Gibco公司；胎牛血清：購自美國Hyclone公司；四甲基偶氮唑藍MTT粉、PBS粉劑、DMSO：購自美國Amresco公司；丙二醛MDA、超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px、乳酸脫氫酶LDH、羥脯氨酸Hyp試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；二氯熒光黃雙乙酸鹽DCFH-DA購自美國Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒由碧云天生物技術研究所提供；細胞凋亡檢測試劑盒由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供；N，N-二甲基甲酰胺、冰醋酸、甲醇購自湖南匯虹試劑有限公司。

1.3細胞培養(yǎng)及蔓越莓對細胞增殖的影響

HaCaT細胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2的條件下的細胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。待細胞融合90%以上時傳代，經0.5%胰蛋白酶消化后用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基以1×105個/mL細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中。當細胞融合80%時，加入含有不同濃度蔓越莓果汁的培養(yǎng)液（不含血清）；處理細胞24 h后，棄掉原培養(yǎng)基并用PBS沖洗1次后，換用含10%胎牛血清MEM培養(yǎng)基進行繼續(xù)培養(yǎng)。計算HaCaT細胞增殖的抑制率/%=（空白對照組OD－各處理組OD）/（空白對照組OD）×100。

1.4細胞分組處理

HaCaT細胞接種到96孔細胞培養(yǎng)板，待細胞融合80%以上后，分為空白對照組（MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞6 h，不用UVB輻射）、UVB輻射模型組（MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞6 h，再采用UVB輻射）、蔓越莓處理組（HaCaT細胞分別用含上述1.3試驗挑選的3個濃度的蔓越莓的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h后，再采用UVB輻射，分別記作蔓越莓低、中、高劑量組）。每組細胞都有6個復孔，棄去細胞培養(yǎng)基，加入適量PBS來覆蓋細胞，再用60mJ/cm2劑量UVB輻射，空白對照組需用鋁箔覆蓋。棄去PBS后，加入10%胎牛血清MEM培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。計算出HaCaT細胞存活率=（各處理組OD）/（空白對照組OD）×100%。

1.5指標測定方法

測定HaCaT細胞增殖活性：每孔加入5mg/mL的MTT 20μL，孵育5 h后棄去上清，再加入150μL DMSO，置于微型振蕩器上低速振蕩8min，多功能酶標儀測定570 nm波長處吸光值（OD570nm值）。

測定MDA、SOD、GSH-Px、Hyp和LDH含量或活力：按照1.4步驟處理各組細胞后，收集各組上清液，并根據(jù)各試劑盒說明書來進行MDA、SOD、GSH-Px、Hyp及LDH活性或含量的測定。

檢測細胞內活性氧ROS含量：UVB輻射后30min收集細胞，棄去原培養(yǎng)基；再加入含10μmol/mL DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱孵育25min；再用無血清培養(yǎng)液沖洗4次，使未進入細胞的DCFH-DA得到充分去除[15]。采用488 nm激發(fā)波長和525 nm發(fā)射波長對氧化型二氯熒光素（DCF）的熒光強度進行檢測。

檢測細胞凋亡率：根據(jù)1.4操作培養(yǎng)于六孔板中的HaCaT細胞，用0.5%胰蛋白酶消化收集細胞，再稀釋成106個/mL單細胞懸液；然后吸取細胞懸液于離心管中，在4℃、2 000 r/min條件下離心10min，棄去上清液并用PBS沖洗3次，再加入200μL的Binding Buffer來懸浮細胞，避光加入Annexin V-FITC試劑5μL并混勻，再加入Propidiun Iodide試劑5μL混勻，避光室溫反應10min左右，然后在1 h內進行流式細胞儀檢測[16]。

1.6數(shù)據(jù)分析

運用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）來表述，組間比較采用單因素ANOVA方差分析。

2　結果與分析

2.1蔓越莓對HaCaT細胞增殖的影響

蔓越莓對HaCaT細胞增殖的影響見圖1所示。

圖1　蔓越莓對HaCaT細胞增值的影響Fig.1　Effectof cranberry on thegrow th of HaCaT cells

蔓越莓果汁對HaCaT細胞增殖具有一定的抑制作用，且抑制率隨給藥濃度的增加而增加；特別是當給藥濃度大于50mg/mL，蔓越莓果汁對細胞增殖的抑制效果很明顯，呈直線上升趨勢。考慮到給藥濃度小于50mg/mL時，對細胞增殖影響不大（抑制率小于10%），因此，蔓越莓12.5、25和50mg/mL 3個質量濃度被設定為蔓越莓低、中和高劑量來應用于后續(xù)的實驗。

2.2蔓越莓對UVB輻射HaCaT細胞活性的影響

蔓越莓對UVB輻射HaCaT細胞活性的影響如表1所示。

表1　不同處理條件下HaCaT細胞的活性Table1　Viability of HaCaT cells atdifferent treatm ent conditions

UVB模型組細胞活性較空白對照組顯著降低，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。隨著蔓越莓各處理組給藥劑量的逐步增大，HaCaT細胞活性提高比較明顯，均與模型組呈顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），且呈劑量依賴關系，從而表明蔓越莓果汁能夠有效地抵御UVB輻射對細胞活性的抑制。

2.3蔓越莓對UVB輻射HaCaT細胞的MDA、SOD和GSH-Px含量的影響

蔓越莓對UVB輻射HaCaT細胞的抗氧化能力的影響見表2所示。

表2　不同處理下HaCaT細胞的MDA、SOD和GSH-Px含量Table2 M DA，SOD and GSH-Px contents of HaCaT cellsw ith different treatments

與空白對照組相比，UVB模型組細胞培養(yǎng)液中MDA含量明顯上升，而SOD和GSH-Px的活力明顯下降，變化達到極顯著水平（P＜0.01），此結果表明HaCaT細胞正常的抗氧化能力損傷明顯。而與模型組比較，蔓越莓各處理組隨著給藥濃度的逐步加大，MDA含量具有下降趨勢，細胞培養(yǎng)液中SOD和GSHPx活力均具有上升趨勢，且變化均達到極顯著水平（P＜0.01）。從而表明蔓越莓果汁的處理能一定程度地修復UVB對HaCaT細胞的氧化損傷。

2.4蔓越莓對UVB輻射HaCaT細胞的LDH活力和Hyp含量的影響

多功能酶標儀檢測結果如表3所示。

表3　不同處理下HaCaT細胞的LDH活力和Hyp含量Table3　LDH activity and Hyp contentof HaCaT cellsw ith different treatments

與空白對照組比較，UVB模型組細胞培養(yǎng)液中LDH活性顯著升高，Hyp含量明顯下降，差異達到極顯著水平（P＜0.01）。而與模型組比較，蔓越莓各處理組預處理細胞24 h后再用UVB照射，細胞培養(yǎng)液中LDH活性極顯著降低和Hyp含量極顯著提高（P＜0.01），從而說明蔓越莓果汁對UVB損傷具有防護作用，不僅保護細胞膜的結構和功能的完整性，而且能促進細胞膠原蛋白合成。

2.5蔓越莓對UVB輻射HaCaT細胞內ROS含量的影響

蔓越莓對UVB輻射HaCaT細胞內ROS含量的影響見表4所示。

表4　不同處理下HaCaT細胞內ROS含量Table4　The contentofROSin HaCaT cellsw ith different treatments

與空白對照組相比，UVB輻射模型組細胞內氧自由基ROS含量極顯著升高（P＜0.01），幾乎達到了2倍的水平。而與模型組比較，蔓越莓各處理組可明顯降低細胞內ROS含量，均達到顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），且各組呈劑量依賴性關系。

2.6蔓越莓對UVB輻射HaCaT細胞凋亡的影響

倒置顯微鏡觀察如圖2A～2C所示，與空白對照組（圖2A）相比較，HaCaT細胞經UVB輻射后，細胞數(shù)量極顯著減少（圖2B）。而與模型組比較，加入高劑量的蔓越莓果汁孵育后，再接受UVB輻射，HaCaT細胞數(shù)目明顯增多，并且細胞形態(tài)也基本正常（圖2C）。從而直觀表明蔓越莓果汁具有一定的防紫外線輻射能力。

流式細胞儀分析如圖2D～2F所示，空白對照組的正常細胞占91.42%（左下象），UVB模型組占74.03%，蔓越莓高劑量組占82.85%。這些結果表明，與空白正常組對比，模型組細胞存活率下降了17.42%；而與模型組比較，蔓越莓高劑量組細胞存活率提高了8.82%，從而進一步說明蔓越莓果汁可以有效抵御紫外輻射導致的細胞凋亡。

3　結論

圖2　各處理組HaCaT細胞的狀態(tài)和凋亡情況Fig.2　Effectsofdifferent treatmentson the statusand apoptosisofHaCaT cells

長期紫外線輻射會誘導細胞產生許多高反應活性的氧自由基，從而使皮膚抗氧化體系遭受破壞，促使機體氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡嚴重，從而進一步誘發(fā)氧化應激產生大量的活性氧自由基；過量的高反應活性自由基會攻擊細胞，引起氧化產物MDA增加和導致脂質過氧化，并可能引起細胞凋亡發(fā)生、突變增加甚至導致皮膚癌等嚴重疾病[2-3]。SOD，GSH-Px等抗氧化酶構成了機體重要的抗氧化體系，能夠減少活性氧自由基和過氧化代謝產物的產生堆積[17]，從而降低細胞氧化損傷和凋亡狀況。同時，為了減弱紫外線尤其UVB輻射所引起的光損傷，應用天然抗氧化劑成為人們保護皮膚的有效措施[8-9]。

蔓越莓是越桔屬植物，又稱蔓越橘，素有“北美紅寶石”之稱，在我國的大興安嶺地區(qū)也比較常見[10]；2007年美國衛(wèi)生部對常食用水果的抗氧化能力進行比較和評估，蔓越莓高居榜首[11]。HaCaT細胞是人皮膚中分離的一種永生化的角質形成細胞，保持有正常人角質形成細胞的分化和增殖特性，常用來替代人表皮角質形成細胞進行光老化體外細胞試驗研究。在本研究中，UVB輻射損傷HaCaT細胞呈典型的凋亡形態(tài)學改變，而經過蔓越莓果汁尤其是高劑量預孵育的HaCaT細胞損傷程度明顯減輕。說明蔓越莓對UVB輻射損傷的人表皮角質形成HaCaT細胞具有光保護作用，并可能與蔓越莓抑制UVB輻射引起的細胞氧化損傷和凋亡，增強其抗氧化能力有關。隨后抗氧化指標的結果顯示，蔓越莓可以顯著提高SOD、GSH-Px活性，加速活性氧自由基的清除以及減少氧自由基的產生，從而使UVB輻射導致的HaCaT細胞脂質過氧化損傷程度明顯減輕。已有報道也指出蔓越莓的抗氧化機制可能是在其所含豐富的原花青素（34.3mg/100 g）、槲皮素（25mg/100 g）、VC（13.5mg/100 g）、花青甙、β-胡蘿卜素等功效因子的綜合作用下通過抑制活性氧自由基的產生，清除過量自由基，提高機體抗氧化酶體系活力等多方面來完成[12，18]。尤其蔓越莓中富含的原花青素，是國際上公認的清除人體自由基最有效的天然抗氧化劑，其抗自由基氧化能力是VE的50倍[13]；它能有效地降低超氧根陰離子自由基和羥自由基的含量，從而有效地控制細胞脂質過度氧化，還進一步保護細胞DNA免受自由基引起的氧化損害[18-19]。

此外，過量的紫外線照射會破壞細胞膜的脂層結構，造成細胞膜通透性變大，導致細胞內乳酸脫氫酶（LDH）外泄進入到細胞培養(yǎng)液中，LDH漏出率成為反映細胞膜損傷的重要指標[20]。羥脯氨酸（Hyp）主要存在于膠原蛋白中，其含量的多少直接反應出膠原蛋白的合成能力[9]，過量紫外線照射會影響細胞膠原蛋白的合成能力。在本研究中，蔓越莓果汁也顯著降低UVB輻射HaCaT細胞培養(yǎng)液中LDH的活性和增加Hyp的含量。這樣一方面蔓越莓保護了細胞膜結構和功能的完整性，能抵抗活性氧自由基對肌膚細胞的損傷，從而延緩皮膚光老化；另一方面能為肌膚提供營養(yǎng)元素，促進膠原蛋白合成，使肌膚變得年輕健康，具有極佳的養(yǎng)顏美容功效。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.22.002

收稿日期：2015-06-29

基金項目：教育部長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃項目（IRT0963）

作者簡介：劉碩（1982—），男（漢），工程師，碩士，研究方向：植物功能成分利用

*通信作者：林勇（1981—），男，講師，博士，研究方向：植物功能成分利用。

Study on the Inhibition Effects of Cranberry on UVB-induced Oxidative Damage and Apoptosisof HaCaT Cells

LIUShuo2，KUANGMeng-ting1，ZHUHua-wei2，LINYong1，*
（1.NationalResearch Centerof Engineering&Technology for Utilization ofBotanicalFunctional Ingredients，Hunan AgriculturalUniversity，Changsha 410128，Hunan，China；2.Infinitus（China）Company Ltd，Guangzhou 510623，Guangdong，China）

Abstract：To study the photo-protection effectof cranberry on HaCaT cells damaged by ultraviolet radiation B （UVB）.HaCaT cellswere first incubated for six hourswith three different doses of cranberry juice，and then irradiated with 60 mJ/cm2dose of UVB.The cell viability was detected by the MTTmethod.The level of malondialdehyde（MDA），hydroxyproline（Hyp）and the activitesofsuperoxidedismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px），lactate dehydrogenase（LDH）ofsupernatantswere determined with the colorimetric methods.The contentofintra-cellular reactive oxygen species（ROS）was testedwith the fluorescencemethod. Compared with the controlgroup，the UVB irradiation could seriously damageHaCaT cells，which lead to29.54% decline in cellviability and obviousdecrease in SOD and GSH-Px activities（P<0.01）.Importantly，compared with the UVBmodel group，cranberry could obviously enhance cell viability（P<0.05 or P<0.01），increase SOD，GSH-Px activities and Hyp content，decrease LDH activity and the contents of MDA and ROS in supernatants under UVB irradiation in dose-dependentmanner（P<0.01 or P<0.05），which lead to thedecreased rate in cell damage and apoptosis.In conclusion，cranberry could relieve UVB-induced oxidative damage and apoptosis of HaCaT cells and exhibit the photo-protection effect，which might be the reasons that cranberryefficiently enhanced the oxidase activity，cleared the oxy-radicals and stimulated the collagen synthesis in cells.

Key words：cranberry；HaCaT cell；ultraviolet radiation B（UVB）；oxidative damage；apoptosis；inhibition effect