miRNA-145抑制肺癌A549細(xì)胞增殖活性的機(jī)制

王丹

（第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部神經(jīng)生物學(xué)教研室，上海200433）

miRNA-145抑制肺癌A549細(xì)胞增殖活性的機(jī)制

王丹

（第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部神經(jīng)生物學(xué)教研室，上海200433）

目的：研究miRNA-145（miR-145）抑制肺癌A549細(xì)胞增殖活性的機(jī)制。方法：應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)Sp1基因3′-UTR區(qū)與miR-145的結(jié)合位點(diǎn)并通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因法進(jìn)行驗(yàn)證；轉(zhuǎn)染miRNA-145擬似物和阻遏物到A549細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-145含量，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中Sp1蛋白含量；同時(shí)采用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24，48和72 h A549細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果：熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證結(jié)果表明，成功預(yù)測(cè)了miR-145與人Sp1基因3′-UTR區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)。與單獨(dú)轉(zhuǎn)染組比較，miR-145擬似物和miR-145阻遏物與野生型熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染可以明顯抑制或增強(qiáng)熒光素酶活性（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染miR-145擬似物和阻遏物能明顯抑制或者促進(jìn)A549細(xì)胞內(nèi)Sp1蛋白的表達(dá)（P均＜0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后48 h，與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，擬似物組細(xì)胞內(nèi)miR-145含量明顯上升，而阻遏組細(xì)胞內(nèi)miR-145含量明顯下降（P均＜0.05），陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組miR-145相對(duì)含量間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染72 h后，擬似物組細(xì)胞增殖活性明顯降低，而阻遏組細(xì)胞活性明顯增高（P均＜0.05）。結(jié)論miR-145通過(guò)抑制Sp1基因表達(dá)，明顯抑制A549細(xì)胞的增殖活性。

轉(zhuǎn)錄因子Sp1；A549細(xì)胞；miR-145；增殖活性

我國(guó)每年新發(fā)肺癌約70萬(wàn)例，對(duì)74個(gè)城市肺癌抽樣調(diào)查顯示，肺癌死亡率占各種惡性腫瘤死亡率的首位［1-2］。因此，尋找潛在的基因靶點(diǎn)和新的治療手段，已成為肺癌治療中迫切需要解決的問(wèn)題。Sp1基因編碼相對(duì)分子質(zhì)量為105 000的蛋白質(zhì)，當(dāng)Sp1蛋白中的激活區(qū)與被調(diào)控基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA結(jié)合后，可以影響基因轉(zhuǎn)錄活性［3］。Sp1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在多種腫瘤，如胃癌、胰腺癌、乳腺癌和甲狀腺腫瘤中都有高表達(dá)［4-5］。多項(xiàng)研究指出，在同一患者體內(nèi)，腫瘤組織中的Sp1蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，且與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6-7］。Sp1在不同類型腫瘤中異常表達(dá)的原因不盡相同，而呈現(xiàn)多樣性。

據(jù)報(bào)道，Sp1蛋白在肺癌中高表達(dá)［8］，而微小RNA（microRNA，miRNAs）則可通過(guò)調(diào)控Sp1蛋白影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［9-10］。我們使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)Sp1基因3′-UTR區(qū)可能存在理論靶位的miRNAs，發(fā)現(xiàn)存在miR-145理論結(jié)合位點(diǎn)。我們據(jù)此推測(cè)，肺癌細(xì)胞內(nèi)Sp1基因高表達(dá)可能與miR-145的低表達(dá)相關(guān)，如果miR-145與Sp1基因具有靶位關(guān)系，很可能肺癌細(xì)胞中miR-145的低表達(dá)會(huì)減弱其對(duì)Sp1基因的調(diào)控作用，這也有可能是腫瘤細(xì)胞中Sp1蛋白高表達(dá)的原因之一。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)has-miR-145與人Sp1之間可能存在的靶位關(guān)系，并通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證；在A549細(xì)胞內(nèi)干預(yù)miR-145，觀察Sp1蛋白表達(dá)以及細(xì)胞增殖能力的變化，進(jìn)而明確miR-145在肺癌調(diào)控中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人肺癌A549細(xì)胞和293細(xì)胞均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑盒（Trizol）及反轉(zhuǎn)錄試劑盒（M-MLV）均為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品，熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體（pGL3-Promoter）和熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)（Promega公司），Sp1蛋白一抗及二抗均為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品，細(xì)胞總蛋白提取及定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒均為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品，miRNA合成、測(cè)序均由Invitrogen公司進(jìn)行，MTT和DMSO為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 儀器和設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品，水平離心機(jī)、高速低溫離心機(jī)以及微量移液器為Eppendorf公司產(chǎn)品，電泳儀、垂直電泳槽及轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于上海天能公司，酶標(biāo)儀及紫外分光光度檢測(cè)儀為Thermo公司產(chǎn)品，PCR儀為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 miR-145靶基因預(yù)測(cè) 采用TargetScan預(yù)測(cè)軟件對(duì)Sp1（NM_003109）3′-UTR區(qū)進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，分析是否存在miR-145的結(jié)合位點(diǎn)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖1），hsa-miR-145在Sp1的3′-UTR區(qū)存在6個(gè)堿基的種子區(qū)。

圖1 hsa-m iR-145與Sp1的靶位關(guān)系預(yù)測(cè)

1.3.2 has-miR-145與Sp1預(yù)測(cè)靶位關(guān)系的驗(yàn)證

1.3.2.1 熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體的構(gòu)建 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293細(xì)胞，Trizol裂解法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。針對(duì)Sp1基因3′-UTR區(qū)設(shè)計(jì)PCR引物：上游引物，5′-GCTCTAGATTGTATATCCTATATAGG-3′，下游引物，5′-GCTCTAGAAAGCATAACAGGGGCCTGATT-3′，引物兩端分別添加XbaⅠ酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增包含miR-145靶位5′-ACTGGA-3′在內(nèi)的219 bp的堿基序列。取2μL cDNA為模板，使用上面引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)為38個(gè)。擴(kuò)增后使用XbaⅠ對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切處理，酶切回收目的片段后克隆至pGL3-Promoter熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，重組載體經(jīng)序列分析后命名為pGL3-Pro-WT-Sp1。以pGL3-Pro-WT-Sp1為基礎(chǔ)，對(duì)miR-145靶位進(jìn)行點(diǎn)突變，即將5′-ACTGGAA-3′突變?yōu)?′-TGAACAG-3′，構(gòu)建突變型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pGL3-Pro-MT-Sp1。對(duì)兩組熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA提取。同時(shí)，化學(xué)法合成miR-145擬似物，miR-145阻遏物和miR-145陰性對(duì)照。

1.3.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光素酶活性檢測(cè) 選取生長(zhǎng)狀況良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3代293細(xì)胞，用胰酶消化并制備細(xì)胞懸液，臺(tái)酚藍(lán)染色后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，使用完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS）調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，將細(xì)胞接種到6孔板，每孔加2 mL細(xì)胞懸液，37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，參照Lipofectmaine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒和RNA共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為9組：293細(xì)胞對(duì)照組，293細(xì)胞+pGL3-WT組，293細(xì)胞+pGL3-MT組，293細(xì)胞+NC+pGL3-WT組，293細(xì)胞+NC+pGL3-MT組，293細(xì)胞+ miR-145擬似物+pGL3-WT組，293細(xì)胞+miR-145擬似物+pGL3-MT組，293細(xì)胞+miR-145阻遏物+pGL3-WT組，293細(xì)胞+miR-145阻遏物+pGL3-MT組。同時(shí)每組細(xì)胞轉(zhuǎn)染100 ng的海腎熒光素酶（pGL-TK）作為熒光霉素活性的檢測(cè)參照。轉(zhuǎn)染后48 h，使用Promega公司的雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)和熒光素酶檢測(cè)儀檢測(cè)熒光素酶含量。

1.3.3 轉(zhuǎn)染miR-145對(duì)肺癌A549細(xì)胞株胞內(nèi)Sp1蛋白表達(dá)的影響

1.3.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，胰酶消化后1 000×g離心2 min收集細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1× 105個(gè)/mL，接種細(xì)胞到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔添加2 mL細(xì)胞懸液，37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染過(guò)程按照Lipofectmaine 2000說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分為4組，即轉(zhuǎn)染對(duì)照組（只加轉(zhuǎn)染試劑），陰性對(duì)照（negative-control，NC）序列轉(zhuǎn)染組，miR-145擬似物轉(zhuǎn)染組（擬似組）和miR-145阻遏物轉(zhuǎn)染組（阻遏組）。

1.3.3.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Sp1的表達(dá)量 轉(zhuǎn)染后48 h，去掉細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入1 mL無(wú)菌PBS洗細(xì)胞2遍，加入0.5 mL細(xì)胞裂解液，按照試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量細(xì)胞總蛋白濃度。定量后的細(xì)胞總蛋白以每組10μL進(jìn)行垂直電泳，SDS-PAGE分離膠濃度為10%，110 V電泳90 min后，立春紅染色觀察蛋白條帶是否完整，400 mA轉(zhuǎn)膜90 min，轉(zhuǎn)膜后以5%脫脂牛奶封閉2 h，4℃一抗孵育過(guò)夜，Sp1和GAPDH一抗稀釋（TBST）比分別為1∶300和1∶1 000；TBST洗膜3次，加入二抗孵育2 h，羊抗鼠二抗稀釋比為1∶4 000；TBST洗膜3次，添加化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)底物，暗室曝光，掃描曝光底片，統(tǒng)計(jì)目的條帶光密度值（D值）。D值目的蛋白/D值GAPDH，即為Sp1蛋白的相對(duì)含量。

1.3.3 A549細(xì)胞增殖活性的檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后48 h，胰酶消化法制備A549細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞沉淀，用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，接種細(xì)胞到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔添加100μL細(xì)胞懸液，輕晃培養(yǎng)板使其分布均勻，37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞，并于接種后的24，48和72 h，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。檢測(cè)前，每孔細(xì)胞加入5mg/mLMTT溶液10μL，輕晃使其分布均勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清，每孔加入150μL DMSO溶液，37℃孵育15 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)細(xì)胞液的D值，根據(jù)D值制作細(xì)胞對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miR-145含量檢測(cè) 細(xì)胞樣本獲取的時(shí)間點(diǎn)與MTT檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)一致，細(xì)胞培養(yǎng)使用6孔板，接種密度為2×105個(gè)/孔。細(xì)胞收集前，每孔使用4℃預(yù)冷的無(wú)菌PBS洗去細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)液及血清；去掉PBS，每孔加入1 mL 4℃預(yù)冷的Trizol細(xì)胞裂解液，震蕩培養(yǎng)板充分裂解細(xì)胞，4℃，12 000×g離心5 min，將分層后的溶液上清轉(zhuǎn)移到無(wú)菌1.5 mL離心管，酚氯仿法抽提RNA，得到沉淀后用20μL DEPC溶解，瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA純度及完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。取2μg的總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，特異反轉(zhuǎn)錄引物：H.sapiens 6 snRNA：5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′，miR-145：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAAGGGAT-3′，取2μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板，熒光定量法檢測(cè)miR-145含量。2ΔΔCt法分析定量結(jié)果，內(nèi)參選用U6（NM_001101.3）。PCR反應(yīng)引物序列：U6上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游引物5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′；miR-145上游引物5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3′，下游引物5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3′。PCR反應(yīng)使用20μL體系，其中，SYBR Premix Ex Taq 10μL，引物（20μmol/L）各取0.2μL，模板使用量為2μL，反應(yīng)體系用無(wú)菌水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件：95℃變性10 s；58℃退火10 s；72℃延伸10 s，循環(huán)數(shù)設(shè)置為40。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 has-miR-145與Sp1靶位關(guān)系驗(yàn)證

2.1.1 熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體構(gòu)建 通過(guò)PCR擴(kuò)增得到特異的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)與DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物比對(duì)，其長(zhǎng)度與理論值（219 bp）完全相符（圖2）。成功構(gòu)建野生型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，并通過(guò)點(diǎn)突變成功構(gòu)建突變型熒光素酶基因表達(dá)載體，測(cè)序分析結(jié)果顯示，與標(biāo)準(zhǔn)序列完全一致（圖3）。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物

圖3 野生型、突變型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體序列分析

2.1.2 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的熒光素酶活性 9組293細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，熒光素酶相對(duì)活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與野生型報(bào)告基因單獨(dú)轉(zhuǎn)染組（293+pGL3-WT）比較，miR-145-擬似物（293+pGL3-WT+miR-145擬似物）能夠明顯抑制野生型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體的熒光素酶活性（P＜0.01），而miR-145阻遏組（293+pGL3-WT+miR-145阻遏物）野生型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體的熒光素酶活性則明顯上升（P＜0.01）。突變性熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體單獨(dú)轉(zhuǎn)染組（293+pGL3-MT）與miR-145擬似物共轉(zhuǎn)染組（293+pGL3-MT+miR-145擬似物）熒光素酶活性間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），miR-145阻遏物轉(zhuǎn)染（293+pGL3-MT+miR-145阻遏物）對(duì)突變型熒光素酶報(bào)告基因活性也無(wú)明顯影響（P＞0.05）；miR-145-NC與pGL3-WT共轉(zhuǎn)染組（293+ pGL3-WT+miR-145-NC）對(duì)野生型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性無(wú)明顯影響（P＞0.05），miR-145-NC與pGL3-MT共轉(zhuǎn)染組（293+ pGL3-MT+miR-145-NC）對(duì)突變型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性亦無(wú)明顯影響（P＞0.05），說(shuō)明RNA轉(zhuǎn)染本身對(duì)熒光素酶活性無(wú)影響。以上數(shù)據(jù)和結(jié)果說(shuō)明，has-miR-145與Sp1基因之間的預(yù)測(cè)靶位確實(shí)存在。見圖4。

圖4 9組293細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性的比較

2.2 轉(zhuǎn)染后各組A549細(xì)胞內(nèi)Sp1蛋白的含量

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，阻遏組細(xì)胞內(nèi)Sp1蛋白含量明顯增加（P＜0.05），而擬似組細(xì)胞內(nèi)Sp1蛋白含量明顯降低（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染對(duì)照組與陰性序列轉(zhuǎn)染組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染過(guò)程對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)Sp1蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。見圖5。

圖5 4組A549細(xì)胞中Sp1蛋白的表達(dá)

2.3 miR-145含量變化對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的影響

細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，轉(zhuǎn)染后48 h和72 h，與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，擬似組A549細(xì)胞增殖活性明顯降低（P＜0.05和0.01），而阻遏組細(xì)胞增殖活性在轉(zhuǎn)染72 h后，明顯高于轉(zhuǎn)染對(duì)照組（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染后24，48和72 h，收集細(xì)胞，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-145含量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后各個(gè)時(shí)間段，擬似組細(xì)胞內(nèi)的miR-145表達(dá)量均明顯高于轉(zhuǎn)染對(duì)照組（P均＜0.05）。而阻遏組miR-145的表達(dá)均明顯低于轉(zhuǎn)染對(duì)照組（24 h和72 h時(shí)P＜0.05，48 h時(shí)P＜0.01）。陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)miR-145表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖6 m iR-145含量變化對(duì)A549細(xì)胞增殖活性的影響

3 討論

miRNAs是一類分布廣泛的內(nèi)源性非編碼RNA，核酸長(zhǎng)度一般為20～25個(gè)堿基。miRNAs具有高度保守的遺傳學(xué)特性，通過(guò)與基因3′-UTR區(qū)的靶點(diǎn)結(jié)合，對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控［11］。miRNA的表達(dá)與多種腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)，可作為腫瘤的標(biāo)志分子［12-15］。研究顯示，固有的miRNA調(diào)控機(jī)制失常是多種腫瘤中癌基因及抑癌基因異常表達(dá)的內(nèi)在原因［16-17］。

Sp1是存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一種基因調(diào)控蛋白，特異性地結(jié)合在受調(diào)控的基因啟動(dòng)子區(qū)域，選擇性活化啟動(dòng)子引導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。Sp1在多種腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后差等密切相關(guān)，提示Sp1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中亦起重要作用。針對(duì)Sp1的研究，多以Sp1作為轉(zhuǎn)錄因子對(duì)其下游基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控展開，而對(duì)于Sp1蛋白本身異常的原因，目前尚未見報(bào)道。尋找Sp1在腫瘤中異常的原因，才能追根溯源，為腫瘤的基因治療提供理論基礎(chǔ)。近幾年來(lái)miRNAs與腫瘤的關(guān)系始終是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，已有報(bào)道顯示miRNAs通過(guò)Sp1對(duì)多種腫瘤產(chǎn)生調(diào)控作用［18-20］。鑒于miR-145與Sp1在A549細(xì)胞中表達(dá)具有顯著相關(guān)性，我們有理由相信，miR-145可能通過(guò)對(duì)Sp1的表達(dá)調(diào)控影響肺癌細(xì)胞A549的生物學(xué)功能。

本研究在miR-145與Sp1表達(dá)具有相關(guān)性的基礎(chǔ)上，通過(guò)生物信息學(xué)方法尋找兩者的結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行位點(diǎn)驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上，嘗試通過(guò)干預(yù)miR-145含量肺癌細(xì)胞產(chǎn)生影響的作用途徑，并最終通過(guò)miRNA調(diào)控理論來(lái)解釋miR-145-Sp1與A549細(xì)胞之間的關(guān)系。研究中，首先利用miRNA靶位的生物學(xué)預(yù)測(cè)在線軟件TargetScan進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在Sp1的3′-UTR有兩處位置存在hsa-miR-145的結(jié)合位點(diǎn)，位于序列保守區(qū)（3′-UTR的第3481-3487位）。進(jìn)一步通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證預(yù)測(cè)的理論幾何位點(diǎn)，miR-145可以通過(guò)其位于保守區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合于3′-UTR，并對(duì)其上游基因翻譯產(chǎn)生抑制作用。而非保守區(qū)位點(diǎn)為無(wú)效位點(diǎn)，之所以出現(xiàn)這樣的原因，可能與位點(diǎn)所處位置有關(guān)，另外，從miRNA進(jìn)化角度考慮，其對(duì)于靶基因結(jié)合區(qū)域的物種間保守性也是要求較高的。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染miR-145擬似物和阻遏物到A549細(xì)胞，Sp1蛋白含量檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法可以在A549細(xì)胞中抑制或增強(qiáng)Sp1蛋白的表達(dá)。其中擬似物轉(zhuǎn)染組胞內(nèi)Sp1蛋白含量較轉(zhuǎn)染對(duì)照組明顯下降，而阻遏物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)Sp1蛋白含量較轉(zhuǎn)染對(duì)照組明顯上升。細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果則表明，過(guò)表達(dá)miR-145可明顯抑制細(xì)胞增殖活性，抑制miR-145則增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖活性。miR-145含量檢測(cè)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后48 h，擬似物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)miR-145成熟體含量明顯上升，而阻遏物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)miR-145含量則較轉(zhuǎn)染對(duì)照組明顯下降。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)提示，miR-145的異常表達(dá)可能是A549細(xì)胞中Sp1基因異常的關(guān)鍵原因。事實(shí)上，通過(guò)干預(yù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)miR-145的含量改變Sp1蛋白表達(dá)，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞A549的增殖也經(jīng)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究的意義在于證實(shí)miR-145是肺癌細(xì)胞中Sp1基因異常表達(dá)的主要調(diào)控因素之一，這為以新的基因?yàn)榘悬c(diǎn)的藥物開發(fā)提供了思路。

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M echanism ofm iRNA-145 inhibits cell proliferation of A549 cells

WANG Dan
（Department of Neurobiology，the Second Military Medical University，Shanghai200433，China）

Objective：To investigate the mechanism underlying how miR-145 inhibits cell proliferation in A549 cells.M ethods：The putativemiR-145 binding sites in the 3′-UTR region of Sp1 gene were predicated by bioinformatics and was predicted by a luciferasemethod.miR-145 levelsweremeasured by qPCR and Sp1 protein levels weremeasured by Western blotting after transiently transfected with eithermiR-145 mimics or inhibitors into A549 cells.MTT assayswere employed to evaluate cell proliferation in A549 cells simultaneously at 24，48 and 72 h after transfection.ResultsThrough report of luciferase analysis，the study successfully predicted and verified the putative miR-145 binding site in the 3′-UTR of human Sp1 gene.The luciferase activity of the wild type is reported that it could be significantly reduced and induced 48 h post-transfection ofmiR-145 mimics and inhibitors respectively and it had significant difference between the above two groups（P＜0.05）.Compared to the control，transfection ofmiR-145 mimics ormiR-145-inhibitors reduced or induced Sp1 protein levelswith the significant difference（P＜0.05）.Data from real-time qPCR indicated that transfection ofmiR-145-mimics and inhibitors induced and reduced miR-145 levels respectively compared to the negative control with a significant difference（P＜0.05）.There was no significant difference between the negative control transfection group and transfection control group（P＞0.05）.Finally，transfection ofmiR-145-mimics and miR-145-inhibitor could significantly reduce and induce cell proliferation of A549 cells.Seventy-two hours post transfection，there had significant difference betweenmiR-145-mimics transfection group and the negative control transfection group（P＜0.05）.Conclusion：miR-145 inhibited cell proliferation of A549 cells through reducing Sp1 gene expression.

book=312,ebook=41

Sp1 transcription factor；A549 cell；miR-145；cell proliferation

R734.2

A

1671-7783（2015）04-0311-06

10.13312/j.issn.1671-7783.y150041

王丹（1980—），女，遼寧大連人，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事膠質(zhì)環(huán)境與神經(jīng)再生研究。

2015-03-06 ［編輯］陳海林