L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵廢菌渣水解固形物回用工藝的研究

耿曉玲，蔡　莉，王均華，王　朋（.江陰職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)紡織工程系，江蘇江陰443；.江陰市食品安全檢測(cè)中心，江蘇江陰443）

L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵廢菌渣水解固形物回用工藝的研究

耿曉玲1，蔡莉1，王均華2，王朋1
（1.江陰職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)紡織工程系，江蘇江陰214431；2.江陰市食品安全檢測(cè)中心，江蘇江陰214431）

摘要：以L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵廢菌渣水解固形物為有機(jī)氮源，進(jìn)行L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵工藝條件的研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)最佳回用工藝條件為：水解時(shí)間20 h，水解溫度90.0℃，水解液加入量6.5 g/100 mL，6.0 mol/L硫酸溶液（mL）與含水廢菌渣固形物（g）之比1∶2.5。在上述條件下，L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量達(dá)到了37.47 g/L，與酵母膏為有機(jī)氮源進(jìn)行的鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵差異不明顯，且產(chǎn)量穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：L-鳥(niǎo)氨酸；廢菌渣；正交試驗(yàn)；工藝條件

L-鳥(niǎo)氨酸作為一種醫(yī)藥、保健品以及化工產(chǎn)品的原料應(yīng)用日趨廣泛[1]，美國(guó)研究發(fā)現(xiàn)L-鳥(niǎo)氨酸可以用作促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌，以增強(qiáng)肌肉合成和提高基礎(chǔ)代謝及預(yù)防肥胖[2]，在歐洲鳥(niǎo)氨酸也作為膳食藥物來(lái)銷(xiāo)售，日本研究者發(fā)現(xiàn)L-鳥(niǎo)氨酸也可以作為食品類(lèi)原料[3-4]。目前在國(guó)際市場(chǎng)上，L-鳥(niǎo)氨酸的絕大部分市場(chǎng)份額被日本占據(jù)，國(guó)內(nèi)有少數(shù)幾家生產(chǎn)，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸研究具有重大的經(jīng)濟(jì)意義和理論意義[5]。但是，國(guó)內(nèi)發(fā)酵法生產(chǎn)鳥(niǎo)氨酸也面臨著資源浪費(fèi)和環(huán)境污染的嚴(yán)重問(wèn)題[6]。在微生物發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵末期的菌體不是目的產(chǎn)物，因此會(huì)產(chǎn)生大量的廢菌渣固形物，其處理方法是將廢菌渣固形物在污水處理廠中分解或是燃燒處理,這不僅污染環(huán)境、破壞生態(tài)，也造成了嚴(yán)重的資源和能源浪費(fèi)[7-10]。本研究擬借鑒國(guó)內(nèi)外的其它發(fā)酵行業(yè)的廢菌渣固形物利用的經(jīng)驗(yàn)，開(kāi)發(fā)谷氨酸棒桿菌廢菌絲體的綜合回收利用工藝，以期能顯著減少?gòu)U液的排放量、節(jié)約資源、避免環(huán)境污染，為國(guó)內(nèi)L-鳥(niǎo)氨酸工業(yè)化高效環(huán)保生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，對(duì)促進(jìn)國(guó)內(nèi)發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的產(chǎn)業(yè)化和醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展有重要的意義。

1　材料與設(shè)備

1.1菌種和廢菌渣固形物

谷氨酸棒桿菌1006（Corynebacterium glutamicum 1006），用其進(jìn)行L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵，發(fā)酵后期收集廢菌渣固形物以備用。

1.2主要儀器與試劑

葡萄糖、硫酸銨、七水合硫酸鎂、碳酸鈣、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等均為分析純；酵母膏、蛋白胨、牛肉浸膏等均為生化試劑。

Cintra2020紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：澳大利亞GBC公司；安捷倫1100高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技公司；AllTech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器：美國(guó)GRACE公司；HR/T20MM立式高速冷凍離心機(jī)：湖南赫西儀器有限公司；HYG-Ⅱ型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海彥承實(shí)業(yè)有限公司；GZX-9140 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱：上海儀純有限公司；SBA-40C型生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1保藏培養(yǎng)基

蛋白胨1.0 g/100 mL，牛肉膏0.5 g/100 mL，NaCl 0.5 g/100 mL，瓊脂2.0，pH 7.00～7.20。

1.3.2活化培養(yǎng)基

葡萄糖0.1 g/100 mL，蛋白胨1.0 g/100 mL，牛肉膏0.5 g/100 mL，NaCl 0.5 g/100 mL，瓊脂2.0 g/100 mL，pH 為7.00～7.20。

1.3.3種子培養(yǎng)基

葡萄糖2.5 g/100 mL，硫酸銨0.5 g/100 mL，硫酸鎂0.3g/100mL，酵母膏0.5 g/100 mL，碳酸鈣0.4 g/100 mL，少量磷酸鹽和生長(zhǎng)因子，pH為7.60～7.80。滅菌條件：121.0℃，保溫10 min。

1.3.4發(fā)酵培養(yǎng)基

1.3.4.1以酵母膏為有機(jī)氮源

葡萄糖9.0 g/100 mL，硫酸銨2.5 g/100 mL，硫酸鎂0.4 g/100 mL，酵母膏3.0 g/100 mL，碳酸鈣1.0 g/100 mL，少量的無(wú)機(jī)磷酸鹽和生長(zhǎng)因子，pH為7.60～7.80。滅菌條件：121.0℃保溫10 min。

1.3.4.2以廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源

葡萄糖9.0 g/100 mL，硫酸銨2.5 g/100 mL，硫酸鎂0.4 g/100 mL，廢菌渣固形物水解液6.5 g/100 mL，碳酸鈣1.0 g/100 mL，少量的無(wú)機(jī)磷酸鹽和生長(zhǎng)因子，pH為7.60～7.80。滅菌條件：121.0℃保溫10 min。

2　方法

2.1指標(biāo)測(cè)定方法

2.1.1發(fā)酵液OD值的測(cè)定

鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵液中含碳酸鈣，用一定濃度的HCl溶液溶解碳酸鈣，將發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)，在660 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度OD值。

2.1.2L-鳥(niǎo)氨酸含量的測(cè)定

采用HPLC-ELSD法定量測(cè)定L-鳥(niǎo)氨酸的含量。色譜柱為Prevail C18（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm），流動(dòng)相為0.14%三氟乙酸（含0.06%七氟丁酸）溶液-乙腈溶液（88∶22）。在流動(dòng)相流量為0.8 mL/min，氣體流量為2.8 mL/min，ELSD檢測(cè)器漂移管溫度為110℃，進(jìn)樣量為20 μL的色譜條件下，將不同濃度的L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以峰面積為橫坐標(biāo)，L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽濃度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程C=1.382 64×10-7A+0.059 37（r=0.999 7）。利用外標(biāo)法，將樣品的峰面積代入回歸方程中，即可求得樣品中L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽的濃度。

2.1.3殘?zhí)橇康臏y(cè)定

采用SBA-40C型生物傳感分析儀測(cè)定殘?zhí)恰?.2廢菌渣固形物的水解方法及條件的確定

本試驗(yàn)采用硫酸水解法進(jìn)行廢菌渣固形物的水解。經(jīng)單因素水解試驗(yàn)，選擇合適的酸濃度、廢菌渣固形物的比例及溫度3個(gè)因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1　Orthogonal test

2.3廢菌渣固形物水解時(shí)間對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的影響

用硫酸溶液直接水解含水廢菌渣固形物，水解時(shí)間不同菌體的水解程度也不同，取一定廢菌渣固形物在一定的水解條件下分別水解不同時(shí)間，然后用于發(fā)酵并檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物量，以確定最佳水解時(shí)間。

2.4調(diào)廢菌渣固形物水解液pH的方式對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的影響

廢酵母水解液新鮮制取時(shí)，pH較低，要用較多的堿性物質(zhì)進(jìn)行調(diào)pH。本試驗(yàn)分別采用CaO、NaOH、NH3· H2O對(duì)廢菌渣固形物水解液回調(diào)pH至7.60～7.80。按搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方，進(jìn)行發(fā)酵并考察試驗(yàn)結(jié)果。

2.5添加廢菌渣固形物水解液含量的確定

在一定的發(fā)酵培養(yǎng)基上依次加不同量的硫酸廢菌渣固形物水解液代替購(gòu)買(mǎi)的硫酸水解的酵母水解液進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，并檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。

2.6連續(xù)回用廢菌渣固形物水解液進(jìn)行L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的分析

以廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行一定批數(shù)搖瓶發(fā)酵，并檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果?？疾霯-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵產(chǎn)物量穩(wěn)定性。

3　結(jié)果與分析

3.1水解廢菌渣固形物條件的確定

若是將廢酵母先烘干再進(jìn)行加酸進(jìn)行水解廢酵母，不僅工序繁多，而且造成能源浪費(fèi)。根據(jù)表1中的試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)廢菌渣固形物直接水解試驗(yàn)，結(jié)果如表2。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2　The orthogonal experiment results and analysis

運(yùn)用極差分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，從表2可以看出，水解廢菌渣固形物最佳條件為：水解溫度為90.0℃，6.0 mol/L硫酸溶液（mL）：廢菌渣固形物（g）為1∶2.5。

3.2廢菌渣固形物水解時(shí)間對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵影響的確定

通過(guò)正交試驗(yàn)確定了廢菌渣固形物水解的主要條件，本試驗(yàn)中采用硫酸溶液直接水解含水菌體，水解時(shí)間對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵也有一定的影響，在水解溫度為90.0℃，6.0 mol/L硫酸溶液（mL）：廢菌渣固形物（g）為1∶2.5的條件下對(duì)濕菌體進(jìn)行水解，在水解時(shí)間為10、15、20、25、30、35 h進(jìn)行取樣，并按1.3.4.2以廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源的配方分別用于發(fā)酵，另外按1.3.4.1以酵母膏為有機(jī)氮源設(shè)置對(duì)照組，并檢測(cè)發(fā)酵情況，以確定最佳水解時(shí)間。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　水解時(shí)間對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的影響Table 3　Effects of hydrolysis time on the fermentation of ornithine

由表3可知，當(dāng)水解時(shí)間超過(guò)20 h，L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量接近對(duì)照組，低于20 h水解的不徹底，L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量不高，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵影響不大，為了確保水解的充分性，水解時(shí)間安排在20 h為最佳。

3.3pH調(diào)節(jié)方式對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的影響

按3.1方法制取的新鮮廢菌渣固形物水解液，pH較低，要用堿性物質(zhì)調(diào)pH。本試驗(yàn)分別采用了CaO、NaOH、NH3·H2O對(duì)廢菌渣固形物水解液回調(diào)pH至7.60～7.80。進(jìn)行發(fā)酵的試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4　調(diào)pH的方式對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的影響Table 4　Effects of the methods of controlling pH on thefermentation of ornithine

可以看出，用氨水回調(diào)pH得到的L-鳥(niǎo)氨酸含量最高為36.87 g/L，可能是用其它兩種物質(zhì)回調(diào)pH，帶來(lái)了大量的Na+和Ca2+，Na+較多，會(huì)對(duì)鈉、鉀ATP酶系統(tǒng)造成影響，而ATP水解直接偶聯(lián)L-鳥(niǎo)氨酸的運(yùn)輸，雖然CaSO4微溶于水，但是Ca2+可以和磷酸鹽和磷酸氫鹽反應(yīng)生成沉淀，在中性和堿性條件下尤為如此，這樣就會(huì)引起磷酸鹽的降低。

故可知廢菌渣固形物水解液制備的工藝為溫度為90.0℃、6.0 mol/L硫酸溶液（mL）：廢菌渣固形物（g）為1∶2.5、水解時(shí)間為20 h，將制取的水解液用氨水調(diào)解pH調(diào)至7.60～7.80。

3.4添加廢菌渣固形物水解液含量的確定

L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵水平的高低和廢菌渣固形物水解液用量之間存在著密切關(guān)系，即L-鳥(niǎo)氨酸的產(chǎn)量會(huì)隨著廢菌渣固形物水解液的濃度發(fā)生改變。添加廢菌渣固形物水解液含量的梯度試驗(yàn)對(duì)于確定添加廢菌渣固形物水解液的最佳含量十分必要。按1.3.4.2以廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源的配方在100 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基上依次用3.5、5.0、6.5、8.0、9.5 g硫酸廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源，以酵母膏為有機(jī)氮源設(shè)置對(duì)照組，檢測(cè)發(fā)酵結(jié)果，試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5　廢菌渣固形物水解液含量對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的影響Table 5　Effects of the hydrolysate content of the fermentation residues

從表5可以看出發(fā)酵液OD值隨廢菌渣固形物水解液的增加而遞增，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中含廢菌渣固形物水解液6.5 g/100 mL，L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量最高，達(dá)到了37.47 g/L，說(shuō)明了用自制廢菌渣固形物水解液取代發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母膏是成功的，試驗(yàn)結(jié)果超過(guò)了對(duì)照組發(fā)酵培養(yǎng)基的水平，可能是因?yàn)閺U菌渣固形物水解成水解液之后，沒(méi)有經(jīng)過(guò)較大的后續(xù)處理，直接當(dāng)作有機(jī)氮源使用，其營(yíng)養(yǎng)成分比經(jīng)過(guò)后續(xù)處理的酵母膏豐富所致。

3.5連續(xù)回用廢菌渣固形物水解液進(jìn)行L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵的研究

第1批按1.3.4.1以酵母膏為有機(jī)氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，氨水調(diào)節(jié)初始pH至7.6～7.8，按5%接種量將種子液接入裝有50mL的發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，8層紗布封口，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上（220 r/min），30℃振蕩培養(yǎng)72 h。檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中最大OD及72 h鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量，發(fā)酵后期收集廢菌渣固形物，制備成具體水解液后，按6.5 g/100 mL廢菌渣固形物水解液量加到發(fā)酵液中，其他按第1批發(fā)酵情況進(jìn)行第2批發(fā)酵，以此類(lèi)推連續(xù)進(jìn)行到第8批發(fā)酵，分別檢測(cè)每批發(fā)酵過(guò)程中最大OD及72 h鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量。以發(fā)酵批數(shù)為橫坐標(biāo)，以每批發(fā)酵過(guò)程中最大OD及72 h鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量為縱坐標(biāo)繪圖。繪制結(jié)果如圖1所示。

圖1　不同批次發(fā)酵過(guò)程中最大OD及L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量Fig.1　Maximum OD and production of L-ornithine in different batches of fermentation

由圖1所示可知用水解溫度為90.0℃，6.0 mol/L硫酸溶液（mL）：廢菌渣固形物（g）為1∶2.5，水解時(shí)間20 h以上，廢菌渣固形物水解液加入量為6.5 g/100 mL的條件進(jìn)行發(fā)酵，由多批次發(fā)酵過(guò)程中最大OD值和L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量表明菌體生物量穩(wěn)定，鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量穩(wěn)定，表明該工藝可行。

4　總結(jié)

本文主要研究了L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵廢菌渣固形物水解液的制備工藝，并將其回用于L-鳥(niǎo)氨酸的發(fā)酵工藝上，得出如下結(jié)論：

1）通過(guò)正交試驗(yàn)法和單因素試驗(yàn)法，對(duì)直接利用含水廢菌渣固形物制取廢菌渣固形物水解液的操作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并確定了廢菌渣固形物水解液替代酵母膏的最佳用量、水解廢菌渣固形物的時(shí)間和調(diào)pH的最佳方式，達(dá)到用酵母膏時(shí)的產(chǎn)酸水平。得到L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵廢菌渣固形物水解液回用工藝最佳條件為：水解溫度為90.0℃、6.0 mol/L硫酸溶液（mL）與含水廢菌渣固形物（g）之比為1∶2.5、水解液加入量為6.5 g/100 mL。

2）通過(guò)連續(xù)回用廢菌渣固形物水解液進(jìn)行L-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵，其L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量穩(wěn)定。

3）分別以酵母膏為有機(jī)氮源和以廢菌渣固形物水解液為有機(jī)氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基檢測(cè)，L-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量相差無(wú)幾，完全可以用廢菌渣固形物水解液代替酵母膏進(jìn)行鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵生產(chǎn)。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.025

收稿日期：2015-08-05

作者簡(jiǎn)介：耿曉玲（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品工程、食品安全。

Study on Reuse Process of Hydrolysis Solids of L-ornithine Fermentation Residues

GENG Xiao-ling1，CAI Li1，WANG Jun-hua2，WANG Peng1
（1.Department of Chemical and Textile Engineering，Jiangyin Polytechnic College，Jiangyin 214431，Jiangsu，China；2.Food Safety Testing Center of Jiangyin District，Jiangyin 214431，Jiangsu，China）

Abstract：Hydrolysis solids of L-ornithine fermentation residues were used as the organic nitrogen source to study the production of L-ornithine by fermentation.The optimized conditions of reuse process were as follows：hydrolysis time 20 h，hydrolysis temperature 90.0℃，hydrolysate 6.5 g/100 mL，the ratio was 1∶2.5 of 6.0 mol/L H2SO4solution（mL）：fungi residues solids containing water（g）.Finally，37.47 g/L of L-ornithine was obtained under these conditions，which was no difference compared with the control group.The yield of the L-ornithine obtained from the continuous reuse process was stable.

Key words：L-ornithine；fermentation residues；orthogonal array design；process conditions