雙酚A類同系物的雌激素效應(yīng)及對MCF-7細(xì)胞的毒性

文 育,雷炳莉,康 佳,張凱瓊,許 潔

(上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院環(huán)境污染與健康研究所,上海 200444)

雙酚A類同系物的雌激素效應(yīng)及對MCF-7細(xì)胞的毒性

文 育,雷炳莉,康 佳,張凱瓊,許 潔

(上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院環(huán)境污染與健康研究所,上海 200444)

雙酚A(bisphenol A,BPA)及其類似物作為聚碳酸酯的主要合成原料,一直是環(huán)境污染的重要問題,其環(huán)境分布及人體暴露是當(dāng)今科學(xué)研究的熱點(diǎn).為評估環(huán)境中BPA類物質(zhì)的毒性效應(yīng),采用MTT比色法檢測了7種BPA類同系物對人雌激素受體(estrogen receptor,ER)缺失乳腺癌細(xì)胞MCF-7(ER–)增殖活性的影響.通過檢測細(xì)胞乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)露出率評估了目標(biāo)物對MCF-7細(xì)胞膜的損傷,結(jié)果表明,在0.01～1.00μmol/L濃度范圍內(nèi),受試化合物對MCF-7細(xì)胞的毒性較小,LDH少量露出;而在10和100μmol/L濃度下,細(xì)胞增殖受到顯著抑制,細(xì)胞膜通透性顯著改變,LDH大量露出.同時采用ER基因雙雜交酵母實驗檢驗了這幾種BPA類同系物的雌激素效應(yīng)大小,通過Logistic模型對曲線進(jìn)行了擬合,并以模型估算的半數(shù)透導(dǎo)活性(EC50)評估了7種BPA類同系物的雌激素效應(yīng)活性,其大小依次為TDP＞BPAF＞4Cl-BPA＞BPC＞BPA＞BPE＞BPAP.這說明其雌激素效應(yīng)機(jī)制可能是通過和ER結(jié)合而產(chǎn)生的.

雙酚A類同系物;雌激素效應(yīng);MCF-7細(xì)胞;細(xì)胞毒性

許多免疫調(diào)查及實驗研究已經(jīng)證實了環(huán)境中存在的內(nèi)分泌干擾化合物(endocrine disrupting contaminants,EDCs)和人類健康及野生生物異常之間的因果關(guān)系[1-2].典型的內(nèi)分泌干擾物雙酚A(bisphenol A,BPA)類同系物是世界上生產(chǎn)量最大化學(xué)品之一,年產(chǎn)量超過36億kg. BPA類同系物是一種重要的有機(jī)化工原料,作為環(huán)氧樹脂、聚碳酸酯塑料以及阻燃劑等產(chǎn)品添加劑,被廣泛應(yīng)用于罐頭內(nèi)包裝、食品包裝材料、牙科填充劑、醫(yī)療設(shè)備、嬰兒用品等塑料行業(yè)生產(chǎn)中[3-5].這些制品在長期使用或者高溫、堿性條件下,BPA類同系物都會緩慢釋放到周圍環(huán)境中,并且很容易在環(huán)境中積累,通過水、空氣、土壤和食品等對周圍生物產(chǎn)生影響[6-7].由于BPA被廣泛應(yīng)用于日常使用的塑料制品中,因此目前有超過80個生物監(jiān)測研究結(jié)果暗示,人類已廣泛地暴露于BPA中[8-9].大量的動物實驗結(jié)果暗示,即使是低水平地暴露在BPA中也會對人體產(chǎn)生不利的健康效應(yīng)[8,10-11].美國成年人群的糠尿病和心血管疾病也與高濃度地暴露在BPA中存在很大的關(guān)聯(lián)[12].因此,BPA類同系物已受到廣泛的關(guān)注并引起人們的爭議.美國食物和藥物機(jī)構(gòu)于2012年7月立法禁止在嬰兒奶瓶和兒童飲水杯中添加BPA[13].由于BPA在日用品中已被許多國家和組織立法禁止使用[13-15],因此BPA類同系物如BPAF, BPF等被發(fā)展作為BPA的替代品,使用在環(huán)氧樹脂、塑料、食品包裝袋等制品中[16-17].但是目前就BPA類同系物對人體健康的毒理學(xué)效應(yīng)研究還比較少[18-19].此外BPA是一個具有弱雌激素效應(yīng)的化合物,其內(nèi)分泌干擾作用是通過和體內(nèi)雌激素受體(estrogen receptor,ER)結(jié)合而顯示的.目前BPA類同系物在人體血液、尿液、組織和其他液體中已被監(jiān)測到[20-23],并且比BPA更難生物降解[24],但對它們是否具有類似于BPA的毒性效應(yīng)、雌激素效應(yīng)以及其雌激素效應(yīng)的作用途徑仍然不是很清楚.

細(xì)胞毒性實驗是生物學(xué)評價體系中最重要的檢測指標(biāo)之一,是體外檢測待測物質(zhì)暴露于受試生物后所產(chǎn)生的生理生化反應(yīng)變化的重要手段,已被廣泛應(yīng)用于評價化合物及環(huán)境樣品的健康毒性效應(yīng)[7,18,25].對雌激素效應(yīng)的篩選方法主要有受體結(jié)合活性法、細(xì)胞增殖法(E-Screen)[26]、重組受體/報告(reporter)基因表達(dá)培養(yǎng)細(xì)胞[27]、酵母法及雙雜交(two-hybrid)酵母法[28]等，其中ER基因雙雜交酵母法因其具有培養(yǎng)簡單、所需時間短、特異高、檢測限低.能對雌激素類化合物的雌激素效應(yīng)進(jìn)行快速篩查等優(yōu)點(diǎn)而逐漸受到人們的青睞.

為了評估BPA類同系物的毒性效應(yīng)及雌激素效應(yīng),本研究通過MCF-7細(xì)胞增殖實驗、細(xì)胞膜損傷實驗及ER基因雙雜交酵母實驗檢測了目標(biāo)化合物的雌激素效應(yīng)及對MCF-7細(xì)胞的毒性效應(yīng).研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究該類化合物的毒性作用機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 目標(biāo)化合物

目標(biāo)化合物為BPA和BPA類同系物,共7種,包括購自百靈威科技有限公司的BPA、4,4-亞乙基雙苯酚(BPE)和4,4-(1-苯乙基)雙酚(BPAP)、4,4-(1-甲基亞乙基)雙(2-甲基苯甲醚)(BPC),以及購自上海梯希愛化成工業(yè)有限公司的四氯雙酚A(4Cl-BPA)和4,4-硫代二苯酚(TDP).所有藥品的純度都大于98%,系列梯度濃度均溶解于DMSO(Sigma,USA)中備用.

1.2 MTT實驗

MTT比色法常用于直接檢測細(xì)胞代謝活性.乳腺癌MCF-7細(xì)胞,購于無錫博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司.在長期培養(yǎng)過程中,由于基因微衛(wèi)星不穩(wěn)定、缺失突變等原因,陽性乳腺癌細(xì)胞會逐漸演變?yōu)殛幮约?xì)胞,此處標(biāo)記為MCF-7細(xì)胞(ER–).MCF-7(ER–)細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 U/L鏈霉素的含10%酚紅的RMPI-1640完全培養(yǎng)基中(Hyclone公司),并于37?C,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育生長.細(xì)胞呈貼壁狀態(tài),待細(xì)胞生長至80%～90%時傳代.所有實驗全部選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞.實驗中采用無酚紅的RPMI-1640培養(yǎng)基為暴露培養(yǎng)基.在實驗之前先用無酚紅的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h,使細(xì)胞體內(nèi)原有的雌激素水平降到最小值.

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中,接種量為100μL/孔,細(xì)胞密度為4 000～6 000個/孔,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h.然后換成無酚紅的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,再分別暴露于不同的BPA類化合物中24,48,72 h,之后棄廢液,加入MTT,4 h后再棄廢液,加入150μL DMSO,用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定OD值,

式中,ODs為樣品的OD值,ODc為對照的OD值.

1.3 乳酸脫氫酶檢測方法

乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)是存在于細(xì)胞漿內(nèi)參與糖酵解最后一步,即丙酮酸和乳酸相互轉(zhuǎn)化時的一種催化酶.作為細(xì)胞受損的一種標(biāo)志性蛋白,在正常情況下,LDH存在于細(xì)胞漿內(nèi),不能透過細(xì)胞膜.當(dāng)細(xì)胞受到損傷時,細(xì)胞膜通透性改變,LDH就從細(xì)胞內(nèi)釋放至培養(yǎng)液中,并在其催化乳酸生成丙酮酸的過程中,使氧化型輔酶I變成還原型輔酶,后者通過遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽還原氯化硝基四氮唑藍(lán)形成甲基化合物,通過光譜吸收檢測產(chǎn)物吸收值來衡量細(xì)胞受損程度.

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于24孔板中,接種量為600μL/孔.隔天換成無酚紅培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,再暴露于不同的BPA類化合物中24 h之后取上清液進(jìn)行實驗.實驗根據(jù)LDH測試盒(南京建成生物工程研究所)說明書進(jìn)行.最后用酶標(biāo)儀于440 nm波長處測定OD值,

式中,ODd為測定的OD值,ODt為標(biāo)準(zhǔn)品的OD值,ODb為空白樣品的OD值,標(biāo)準(zhǔn)品濃度為2 mmol/L.

1.4 ER基因雙雜交酵母實驗

ER基因雙雜交酵母實驗主要用來檢測能與ER競爭的類似物、抗雌激素化合物和環(huán)境樣品的類似物、抗雌激素活性.雌激素效應(yīng)的測定方法可參照文獻(xiàn)[29],具體的實驗材料與儀器如下:O-nitrophenol-β-D-galactopyranoside(ONPG),購自東京化成;17β-雌二醇(E2,陽性對照)、無氨基酵母氮源和氨基酸,購自美國Sigma公司;溶解酶Zymolyase(20 T),購自日本生化學(xué)工業(yè);雙雜交酵母基因工程菌株Y190,日本大坂大學(xué)西川淳一教授惠贈送;BIO-RAD 550酶標(biāo)儀和DMSO(ACS級),購自AMRESCO.取在30?C條件下培養(yǎng)了14～16 h的酵母菌50μL加入裝有200μL培養(yǎng)基的1.5 mL的EP管中,再添加2.5μL的樣品溶液(DMSO溶解液),震蕩搖勻.置于DNA混合器上培養(yǎng)4 h(30?C).移取150μL上清液于96孔酶標(biāo)板中,在595 nm波長下測定菌液的OD值.余下的溶液以12 000 r/min離心5 min.棄去上清液后,加入200μL含1 mg/mL Zymolyaser的Z bu ff er溶液.震蕩混勻后,靜置反應(yīng)20 min(30?C),加入100μL 1 mol/L的Na2CO3溶液使反應(yīng)停止.于12 000 r/min離心5 min,吸取上清液150μL于96孔酶標(biāo)板中,分別于414和570 nm波長下測定OD值.ONPG活性的計算公式如下:

式中,t為加入ONPG后的反應(yīng)時間(min),v為菌液體積(0.05 mL).

2 結(jié)果與討論

2.1 MTT結(jié)果

MCF-7細(xì)胞在體外長期培養(yǎng)后會發(fā)生ER丟失現(xiàn)象[30],但細(xì)胞形態(tài)并未改變,且與正常乳腺癌細(xì)胞有相同的生物學(xué)活性.有研究發(fā)現(xiàn),MCF-7(ER–)細(xì)胞生長速度更快,在小鼠體內(nèi)成瘤的速度也更快,可能與其增殖依賴于MCF-7(ER+)細(xì)胞不同的信號通路有關(guān)[7].本實驗以MCF-7(ER–)作為指示細(xì)胞,用MTT法快速檢測了該細(xì)胞的增殖活性,結(jié)果如圖1所示.可見,BPA類同系物在低濃度時對MCF-7細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出了一定的促進(jìn)作用,與空白對照相比,雖然存在顯著性差異,但其增殖比率基本都低于1.6倍.BPA類同系物的促增殖效應(yīng)隨劑量變化不明顯,但BPAP,BPAF和TDP均表現(xiàn)出了一定的時間效應(yīng)依賴關(guān)系,即隨著暴露時間的延長,其增殖效應(yīng)也增強(qiáng).這說明BPA類同系物在低濃度下具有一定的雌激素效應(yīng),并且其雌激素效應(yīng)的強(qiáng)弱與暴露時間存在一定的關(guān)系.BPA的MTT實驗只進(jìn)行了24 h,沒有表現(xiàn)出對MCF-7細(xì)胞的促增殖效應(yīng).BPA及其同系物基本在暴露濃度為10或100μmol/L時,表現(xiàn)出了對MCF-7細(xì)胞的毒性效應(yīng).當(dāng)暴露濃度為100μmol/L時,其增殖比率基本都在0.4以下,當(dāng)暴露時間為72 h時,其對MCF-7細(xì)胞的毒性效應(yīng)要強(qiáng)于暴露時間為24 h時.張帥帥等[7]研究了5種BPA類同系物對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率,同樣得出了在10-5和10-4μmol/L時表現(xiàn)出毒性效應(yīng)的結(jié)果.這說明受試BPA類同系物除了BPE,均在低濃度時表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖,在高濃度時抑制細(xì)胞增殖的毒性效應(yīng),說明BPA類同系物與BPA類似,具有促細(xì)胞增殖效應(yīng),其促進(jìn)細(xì)胞增殖的途徑可能與乳腺癌細(xì)胞的增殖信號通路有關(guān)[31].雌激素類化合物可通過與核受體途徑(如nER)和膜受體途徑(如GPR30)結(jié)合而調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄,如促進(jìn)細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞的凋亡等[32-33].已有研究發(fā)現(xiàn),BPAF可通過ER信號通路和GPR30信號通路調(diào)節(jié)途徑促進(jìn)行乳腺癌細(xì)胞T47D和MCF-7細(xì)胞的增殖[34-35].因此,本研究雖然使用的是MCF-7(ER–)細(xì)胞,但其增殖效應(yīng)可以通過膜受體途徑(GPR30)產(chǎn)生,具體的促增殖效應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路需要通過相關(guān)靶蛋白及靶基因的表達(dá)來進(jìn)一步驗證.

2.2 LDH結(jié)果

細(xì)胞膜通透性的改變是許多毒性物質(zhì)作用于細(xì)胞膜時一種常見的早期反應(yīng),因此細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性的高低可間接地反映受試物的毒性大小[36].通過檢測培養(yǎng)液中的LDH值可以反映目標(biāo)化合物對MCF-7細(xì)胞膜損傷的程度(見圖2).從MTT實驗結(jié)果得出,當(dāng)暴露濃度大于1μmol/L之后,BPA類同系物就已經(jīng)開始產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng),且在暴露濃度為100μmol/L時細(xì)胞基本趨于死亡.因此,LDH實驗濃度選擇在1～100μmol/L范圍內(nèi).由圖2可見,這幾種化合物基本都是在低濃度(0.1,1,10μmol/L)時LDH露出率較低,而在25,50和100μmol/L時,除BPE外,其他幾種化合物的LDH露出率均較高,并且呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)依賴關(guān)系;在任何一個暴露濃度下,BPE對MCF-7細(xì)胞的LDH露出率基本沒有影響.從MTT實驗結(jié)果也可以發(fā)現(xiàn),BPE在暴露時間為24 h時,對MCF-7細(xì)胞的毒性效應(yīng)較小,說明細(xì)胞膜損傷較小,因此LDH的露出率較低.MTT和LDH實驗結(jié)果的聯(lián)合應(yīng)用已被很好地應(yīng)用于檢測有毒物質(zhì)對受試細(xì)胞的毒性效應(yīng),二者在結(jié)果上互為印證[36-37],為進(jìn)一步研究細(xì)胞凋亡、增殖、分化等生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制機(jī)理提供了更為可靠的基礎(chǔ)數(shù)據(jù).本研究中LDH的露出率結(jié)果同樣能夠很好地解釋MTT的實驗結(jié)果.

圖1 不同濃度的BPA類同系物對MCF-7細(xì)胞增殖的毒性效應(yīng)Fig.1 Proliferation toxicity of BPA analogues on MCF-7 cells

圖2 不同濃度的BPA類同系物對MCF-7細(xì)胞膜損傷的影響Fig.2 In fl uence of BPA analogues on MCF-7 cell membrane damage

2.3 目標(biāo)化合物的雌激素效應(yīng)結(jié)果

用雙雜交酵母法所測得的陽性對照物質(zhì)E2的劑量效應(yīng)如圖3所示.可以看出,當(dāng)E2濃度為0.625μmol/L時,其作用活性達(dá)到最高值,且在此濃度后進(jìn)入平臺期.圖4描述了不同BPA類同系物的ER基因雙雜交酵母實驗檢測結(jié)果.可見,E2和BPA類同系物都具有雌激素效應(yīng),只是E2的雌激素效應(yīng)更強(qiáng).使用Logistic模型對曲線進(jìn)行擬合,得出了各物質(zhì)的EC50值(見表1),其中E2的EC50值為0.12μmol/L(此為外暴露濃度,若按內(nèi)暴露濃度計算,其EC50值為1.2 nmol/L,與使用類似方法得出的0.25和0.201 nmol/L值在同一個數(shù)量級[38-39].總體上來說,BPA類同系物的EC50值要比E2小3～4個數(shù)量級.從EC50值上可以判斷,其雌激素活性大小分別為TDP＞BPAF＞4Cl-BPA＞BPC＞BPA＞BPE.由于BPAP在測定的濃度范圍內(nèi)沒有表現(xiàn)出雌激素效應(yīng),因此沒有計算出有效的EC50值.本實驗同時計算了各種物質(zhì)的相對作用活性,并以E2最高作用活性(0.625μmol/L時的作用活性)的5%,10%,20%和30%時對應(yīng)的各物質(zhì)的濃度來表示,將其表示為REC5,REC10,REC20和REC30,結(jié)果如表1所示.可以看出:以REC5為基準(zhǔn),相對活性大小為TDP＞BPAF＞BPA＞4Cl-BPA＞BPC＞BPE;以REC10為基準(zhǔn),相對活性大小為TDP＞BPAF＞BPA＞BPC＞4Cl-BPA＞BPE;以REC20和REC30為基準(zhǔn),相對活性大小均為TDP＞BPAF＞BPA＞BPC＞BPE＞4Cl-BPA.可以看出,在這幾種情況下,TDP的相對活性均最高,其次為BPAF和BPA.而BPC,BPE,4Cl-BPA的相對活性根據(jù)REC值的不同而不同.這些結(jié)果同樣也與MTT實驗結(jié)果一致.通過這種相對活性的方法,可以更直觀地比較各種BPA類同系物在不同濃度下雌激素活性的強(qiáng)弱.已有研究表明,BPA的弱雌激素效應(yīng)是通過與體內(nèi)雌激素受體(如ER受體和GPR30受體)結(jié)合而產(chǎn)生的[38,40].本研究結(jié)果說明,BPA類同系物的雌激素效應(yīng)可能類似于BPA,也是通過與ER結(jié)合而顯示.BPA類同系物對MCF-7(ER–)細(xì)胞表現(xiàn)出較弱的增殖效應(yīng),也在一定程度上印證了這一點(diǎn).

圖3 不同濃度的E2誘導(dǎo)的ONPG活性Fig.3 Activities of ONPG induced by E2

圖4 不同濃度的BPA類同系物誘導(dǎo)的ONPG活性Fig.4 Activities of ONPG induced by BPA analogues

表1 BPA類同系物的雌激素活性Table 1 Estrogenic activities of BPA analogues (μmol·L-1)

3 結(jié)論

(1)BPA類同系物在低濃度時對MCF-7(ER–)細(xì)胞的增殖具有較弱的促進(jìn)作用,在高濃度時表現(xiàn)出毒性效應(yīng).LDH實驗結(jié)果能夠很好地解釋BPA類同系物對MCF-7細(xì)胞的MTT實驗結(jié)果.

(2)人ER基因雙雜交酵母實驗結(jié)果表明,BPA類同系物與BPA一樣具有雌激素受體效應(yīng),說明BPA類同系物可能類似于BPA,其雌激素效應(yīng)機(jī)制可能是通過與ER結(jié)合而顯示的.

致謝 本研究的酵母實驗是在北京大學(xué)胡建英教授課題組完成的,在此表示感謝!

[1]HUANG Y Q,WONG C K,ZHENG J S,et al.Bisphenol A(BPA)in China:a review of sources, environmental levels,and potential human health impacts[J].Environment International,2012, 42:91-99.

[2]JOBLING S,TYLER C R.Endocrine disruption in wild freshwater fi sh[J].Pure and Applied Chemistry,2003,75:2219-2234.

[3]VANdENBERG L N,COLBOM T,HAYES T B,et al.Hormones and endocrine-disrupting chemicals:low-dose e ff ects and nonmonotonic dose response[J].Endocrine Reviews,2012,33:378-455.

[4]SCHMIdT J,KOTNIK P,TRONTELj J,et al.Bioactivation of bisphenol A and its analogs(BPF, BPAF,BPZ and DMBPA)in human liver microsomes[J].Toxicology in Vitro,2013,27:1267-1276.

[5]劉紅玲,劉曉華,王曉蓉,等.雙酚A和四溴雙酚A對大型蚤和斑馬魚的毒性[J].環(huán)境科學(xué),2007, 28:1784-1787.

[6]JI K,HONG S,KHO Y,et al.E ff ects of bisphenol S exposure on endocrine functions and reproduction of zebra fi sh[J].Environmental Science Technology,2013,47:8793-8800.

[7]張帥帥,劉堰,劉樹深,等.不同終點(diǎn)檢測5種雙酚A類化合物對MCF-7的細(xì)胞毒性[J].環(huán)境科學(xué), 2012,33(11):3935-3940.

[8]VANdENBERG L N,CHAHOUd I,HEINdEL J J,et al.Urinary,circulating,and tissue biomonitoring studies indicate widespread exposure to bisphenol A[J].Ci?encia&Sa′ude Coletiva,2010, 17:407-434.

[9]CALAFAT A M,YE X,WONG L Y,et al.Exposure of the U.S.population to bisphenol A and 4-tertiary-octylphenol:2003—2004[J].Environmental Health Perspectives,2008,116:39-44.

[10]BONdESSON M,JONSSON J,PONGRATZ I,et al.A CASCADE of e ff ects of bisphenol A[J]. Reproductive Toxicology,2009,28:563-567.

[11]VOMSAAL F S,AKINGEMI B T,BELCHER S M,et al.Chapel Hill bisphenol A expert panel consensus statement:integration of mechanisms,e ff ects in animals and potential to impact human health at current levels of exposure[J].Reproductive Toxicology,2007,24:131-138.

[12]LANG I A,GALLOWAY T S,SCARLETT A,et al.Association of urinary bisphenol A concentration with medical disorders and laboratory abnormalities in adults[J].Journal of the American Medical Association,2008,300:1303-1310.

[13]FDA.Bisphenol A(BPA):use in food contact application,2012[EB/OL].[2012-12-25]. http://www.fda.gov/NewsEvents/PublicHealthFocus/ucmo64437.htm.

[14]NCSL.NCSL policy update:state restrictions on bisphenol A(BPA)in consumer products, 2012[EB/OL].[2012-12-05].http://www.ncsl.org/issues-research/env-res/policy-update-onstate-restrictions-on-bisphenol-a.aspx.

[15]EC.Amending directive 2002/72/EC as regards the restriction ofuse ofbisphenolA in plastic infant feeding bottles, 2011 [EB/OL].[2012-12-05].http://eurlex. europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?ur=OJ:L:2011:026:0011:0014:EN:PDF.

[16]SUEIRO R A,SUAREZ S,ARAUjO M,et al.Mutagenic and geno toxic evaluation of bisphenol F diglycidyl ether(BFDGE)in prokaryotic and eukaryotic systems[J].Mutation Research,2003, 536:39-48.

[17]FENG Y,YIN J,JIAO Z,et al.Bisphenol AF may cause testosterone reduction by directly a ff ecting testis function in adult male rats[J].Toxicology Letters,2012,211:201-209.

[18]JIN S W,HUANG Y,LI M,et al.Cytotoxicity of bisphenol A and tetrabromobishphenol A on HepG2 cells[C]//Conference on Environmental Pollution and Public Health.2010:259-262.

[19]SUI Y P,AI N,PARK S H,et al.Bisphenol A and its analogues activate human pregnane X receptor[J].Environmental Health Perspectives,2012,120:399-405.

[20]LIAO C Y,KANNA K.Concentrations and pro fi les of bisphenol A and other bishpenol analogues in foodstu ff s from the United States and their implications for human exposure[J].Agricultural and Food Chemistry,2013,61:4655-4662.

[21]LIAO C Y,LIU F,GUO Y,et al.Occurrence of eight bisphenol analogues in indoor dust from the United States and several Asian countries:implications for human exposure[J].Environmental Science and Technology,2012,46:9138-9145.

[22]LIAO C Y,LIU F,MOON H B,et al.Bisphenol A analogues in sediments from industrialized areas in the United Sates,Japan,and Korea:spatial and temporal distributions[J].Environmental Science and Technology,2012,46:11558-11565.

[23]YANG Y J,YIN J,YANG Y,et al.Determination of bisphenol AF(BPAF)in tissues,serum, urine and feces of orally dosed rats by ultra-high-pressure liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B,2012,901:93-97.

[24]IKE M,CHEN M Y,DANZL E,et al.Biodegradation of a variety of bisphenols under aerobic and anaerobic conditions[J].Water Science and Technology,2006,53:153-159.

[25]康佳,雷炳莉,劉倩,等.上海河流沉積物的有機(jī)提取物對3種細(xì)胞的毒性效應(yīng)[J].上海大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2013,19:393-399.

[26]SOTO A M,SONNENSCHEIN C,CHUNG K L,et al.The E-Screen assay as a tool to identify estrogens:an update on estrogenic environmental pollut ants[J].Environmental Health Perspectives, 1995,103(S7):113-122.

[27]JUGAN M L,OZIOL L,BIMBOT M,et al.In vitro assessment of thyroid and estrogenic endocrine disruptors in waste water treatment plants,rivers and drinking water supplies in the greater Paris area(France)[J].Science of the Total Environment,2009,407:3579-3587.

[28]JIANG W W,YAN Y,MA M,et al.Assessment of source water contamination by estrogenic disrupting compounds in China[J].Journal of Environmental Sciences,2012,24:320-328.

[29]胡建英,謝國紅.酵母雙雜交系統(tǒng)測定抗雌激素物質(zhì)[J].北京大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2003,39: 449-453.

[30]SOMMER S,FUQUA S A W.Estrogen receptor and breast cancer[J].Seminars in Cancer Biology, 2001,11(5):339-352.

[31]PUpO M,PISANO A,LAppANO R,et al.Bisphenol A induces gene expression changes and proliferative e ff ects through GPER in breast cancer cells and cancer-associated fi broblasts[J]. Environmental Health Perspectives,2012,120(8):1177-1182.

[32]李蘇華,鄧華瑜.雌激素對乳腺癌細(xì)胞的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2008, 39(4):344-346.

[33]YU X Y,FILARdO E J,SHAIKH Z A.The membrane estrogen receptor(GPR30)mediates cadmium-induced proliferation of breast cancer cells[J].Toxicology and Applied Pharmacology, 2010,245:83-90.

[34]BERMUdEZ D,GAY L E,Jr.,WILSON V S.Modeling the interaction of binary and ternary mixtures of estradiol with bisphenol A and bisphenol AF in an in vitro estrogen-mediated transcriptional activation assay(T47D-Lbluc)[J].Toxicological Sciences,2010,116:477-487

[35]LI M,GUO J,GAO W H,et al.Bisphenol AF-induced endogenous transcription is mediated by ERα and ERK1/2 activation in human breast cancer cells[J].POLE ONE,2014,9:1-8.

[36]NATARAjAN N,THAMARAISELVAN R,LINGAIAH H,et al.E ff ect of fl avonone hesperidin on the apoptosis of human mammary carcinoma cell line MCF-7[J].Biomedicine&Preventive Nutrition,2011,1:207-215.

[37]JEONE C E,YEON J J,GUN-HEE K.Genistein inhibits the proliferation and di ff erentiation of MCF-7 and 3T3-L1 cells via the regulation of ER alpha expression and induction of apoptosis[J].Experimental and Therapeutic Medicine,2014,8:454-458.

[38]LI J,MA M,WANG Z J.In vitro pro fi ling of endocrine disrupting e ff ects of phenols[J].Toxicology in Vitro,2010,24:201-207

[39]劉倩,雷炳莉,安靜,等.兩種實驗設(shè)計研究DES和EV對MCF-7細(xì)胞增殖的聯(lián)合作用[J].環(huán)境科學(xué),2013,34:3303-3308.

[40]DONG S,TERASAKA S,KIYAMA R.Bisphenol A induces a rapid activation of Erk1/2 through GPR30 in human breast cancer cells[J].Environmental Pollution,2011,159:212-218.

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Estrogen activity and toxicity e ff ects of bisphenol A analogues on MCF-7 cells

WEN Yu,LEI Bing-li,KANG Jia, ZHANG Kai-qiong,XU Jie
(Institute of Environmental Pollution and Health,School of Environmental and Chemical Engineering, Shanghai University,Shanghai 200444,China)

Bisphenol A(BPA)and its analogues as main raw materials for synthesis of polycarbonate are important issue of environmental pollution.Most of the current studies focus on PBA analogues’environmental distribution and human exposure.To evaluate the cytotoxic e ff ects of BPA analogues,MTT assay was used to assess the proliferation toxicity of 7 kinds of BPA analogues on MCF-7(ER–),when ER is estrogen receptor.At the same time,releases of lactate dehydrogenase(LDH)escaping into cell culture medium were detected to evaluate the damage of cell membrane.The results showed that in the concentration ranges of 0.01～1.00μmol/L,the toxic e ff ects of tested compounds on MCF-7 cells were small and only a small amount of LDH were released.At concentrations of 10 and 100μmol/L,cell proliferation was signi fi cantly inhibited.Permeability of cell membranewas greatly changed,and lots of LDH were released.In addition,ER gene two-hybrid yeast bioassay was used to evaluate the estrogen e ff ects of BPA analogues.All the dose-response relationships were described by logistic function.The estrogenic activity expressed by EC50 were TDP＞BPAF＞4Cl-BPA＞BPC＞BPA＞BPE＞BPAP.The results shows that the estrogenic e ff ect mechanism is due to the binding of that target compounds and ER.

bisphenol A(BPA)analogues;estrogenic e ff ect;MCF-7 cells;cell toxicity

X 3

A

1007-2861(2015)04-0515-10

10.3969/j.issn.1007-2861.2014.04.021

2013-12-18

高校青年骨干教師國內(nèi)訪問學(xué)者計劃資助項目(60C11113001);長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃資助項目(IRT13078)

雷炳莉(1979—),女,副研究員,博士,研究方向為環(huán)境毒理學(xué)與環(huán)境風(fēng)險評價.

E-mail:leibingli@126.com