黃芩素對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖與凋亡的影響

王寧，暢靈麗，程琦，張延新

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南漯河462000）

·論著·

黃芩素對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖與凋亡的影響

王寧，暢靈麗，程琦，張延新

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南漯河462000）

目的探討黃芩素對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖與凋亡的影響及可能的機(jī)制。方法噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)黃芩素對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響，Hoechst 33258染色觀察黃芩素處理后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)SW480細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，比色法檢測(cè)黃芩素作用后細(xì)胞Caspase-3活性的變化。結(jié)果黃芩素能夠抑制SW480細(xì)胞增殖，呈劑量、時(shí)間依賴性。150μmol黃芩素作用SW480后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，150μmol黃芩素作用細(xì)胞后引起的凋亡率顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。黃芩素可以提高細(xì)胞Caspase-3活性并呈劑量依賴性。結(jié)論黃芩素可以抑制SW480細(xì)胞增殖，并可能通過Caspase-3依賴性通路誘導(dǎo)凋亡。

黃芩素；結(jié)腸腫瘤；SW480細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

結(jié)腸癌已成為一種日益嚴(yán)重的健康問題，是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。特別是在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，其已成為癌癥患者高死亡率的主要原因之一[1-3]。在我國(guó)惡性腫瘤患者中，結(jié)腸癌的發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌，位居第3位，死亡率位居第5位[4]。

黃芩屬唇形科黃芩屬植物，為多年生草本植物，以干燥根入藥，是常用的傳統(tǒng)中藥之一，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌及抗炎活性[5-7]。黃芩素是黃芩根中的主要黃酮類化學(xué)成分。有研究表明，黃芩素能抑制膠質(zhì)瘤和骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8-9]。目前，黃芩素對(duì)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的影響及作用機(jī)制還不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)以人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480為研究對(duì)象，觀察黃芩素對(duì)SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，探討黃芩素在結(jié)腸癌中的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芩素、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（商品名：噻唑藍(lán)）[3-（4，5-dimethylthi ahiazo-z-y1）-2，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]和Hoechst33258購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Annexin V-FITC kit購(gòu)自德國(guó)Calbiochem公司；無血清細(xì)胞凍存（dulbecco modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Caspase-3檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioVision公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480購(gòu)于上海生物研究所，來源為人結(jié)腸低分化黏液腺癌。SW480細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放置在37℃、5％二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中。經(jīng)胰蛋白酶消化、傳代，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率取收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞，常規(guī)消化制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液以200μl/孔接種于96孔板，5％CO2、37℃培養(yǎng)24 h。將實(shí)驗(yàn)分為4組，前3組分別加入相應(yīng)的黃芩素溶液并使其最終濃度分別為25、50和100μmol，第4組為空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48和72 h后每孔加入濃度為5 mg/ml MTT溶液10μl，孵育4 h后終止，振蕩15 min，選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度光密度（optical density，OD）值，并按照以下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（inhibition rate，IR）：IR=（1-空白組OD值/實(shí)驗(yàn)組OD值）×100％。根據(jù)抑制率曲線擬合48 h濃度與抑制率曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)將單細(xì)胞懸液接種于6孔板，5％CO2、37℃培養(yǎng)24 h，加入黃芩素溶液并使其最終濃度為100μmol，設(shè)立空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，將細(xì)胞固定在4％多聚甲醛中10 min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2次，加入0.5 ml濃度為10μg/ml Hoechst 33258染色液，5 min后棄去染液并用PBS清洗2次。染色后用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡調(diào)整SW480細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml，2 ml/孔接種于6孔板中。待細(xì)胞貼壁后，分別加入相應(yīng)的黃芩素溶液并使其最終濃度分別為25、50和100μmol，設(shè)立空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。胰酶消化后，4℃、300×g離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞。PBS清洗2次后，加入100μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，再加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI，混勻、避光，室溫反應(yīng)10 min。加入400μl 1×Binding Buffer，混勻。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 Caspase-3活性檢測(cè)收集SW480對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后分別加入相應(yīng)的黃芩素溶液并使其最終濃度分別為25、50和100μmol，設(shè)立空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48和72 h。收集細(xì)胞，100×g離心后棄上清液，加入細(xì)胞裂解液，充分混勻，冰上裂解20 min后離心，將上清液移入新的離心管并放置冰上，測(cè)定各樣品的蛋白濃度。取等量的樣品接種于96孔板，每孔加入50μl 2×反應(yīng)液及5μl濃度為4mmol顯色反應(yīng)底物，混勻后37℃孵育1h。在405nm處測(cè)定其OD值。對(duì)照組計(jì)算值設(shè)定為100％，實(shí)驗(yàn)組值=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100％。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析來進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

圖1 不同濃度黃芩素對(duì)SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

2.1MTT比色法分析細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

體外實(shí)驗(yàn)表明，黃芩素對(duì)SW480細(xì)胞有直接抑制作用，并呈現(xiàn)劑量、時(shí)間依賴性（見圖1）。作用48 h后，100μmol濃度的黃芩素對(duì)細(xì)胞的抑制作用最明顯，達(dá)51.32％，與其他處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（見表1）。72h檢測(cè)細(xì)胞抑制率低于48h，但相同濃度下72 h與48 h抑制率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)擬合曲線計(jì)算其半數(shù)抑制濃度IC50=93.51μmol。

2.2 SW480細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

100μmol黃芩素作用SW480細(xì)胞48 h，經(jīng)10μg/ml Hoechst 33258染色處理5 min后，與對(duì)照組細(xì)胞比較，熒光顯微鏡可觀察到黃芩素處理組的細(xì)胞核中染色質(zhì)凝集、固縮，形成明顯的凋亡小體。見圖2。

表1 不同濃度黃芩素對(duì)SW480細(xì)胞增殖的抑制率（s）

表1 不同濃度黃芩素對(duì)SW480細(xì)胞增殖的抑制率（s）

黃芩素12 h24 h36 h48 h72 h 25μmol4.55±2.3510.13±2.3714.19±3.0219.38±4.3816.89±4.95 50μmol7.06±1.1216.32±2.7222.83±3.4930.52±5.3329.88±5.64 100μmol12.05±3.4925.88±3.5635.63±4.0751.32±4.4345.72±7.03P值（25μmol vs 50μmol）0.1700.0410.0320.0490.040P值（50μmol vs 100μmol）0.0780.0210.0140.0070.038P值（25μmol vs 100μmol）0.0370.0030.0020.0020.004

圖2 黃芩素作用48 h后SW480細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化（×400）

2.3各組SW480細(xì)胞的凋亡

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黃芩素作用于SW480細(xì)胞的凋亡結(jié)果

表2 不同濃度黃芩素對(duì)SW480細(xì)胞Caspase-3活性的影響（±s）

表2 不同濃度黃芩素對(duì)SW480細(xì)胞Caspase-3活性的影響（±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與對(duì)照組比較，P＜0.01

組別12 h24 h48 h72 h Caspase-3活性Caspase-3活性Caspase-3活性Caspase-3活性P值對(duì)照組100±00.419138±210.0351）122±250.202107±200.577 25μmol組113±250.0421）285±240.0002）213±160.0002）145±200.0181）50μmol組153±310.0012）395±330.0002）352±360.0002）321±410.0002）100μmol組252±290.419138±210.0351）122±250.202107±200.577P值P值P值

不同濃度的黃芩素作用SW480細(xì)胞48 h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。對(duì)照組、25、50和100μmol黃芩素處理組的凋亡率分別為（4.43±1.82）％、（5.57±2.19）％、（9.01±1.56）％和（14.89±2.04）％。與對(duì)照組比較，50μmol黃芩素處理組凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.029）；100μmol黃芩素處理組凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）。見圖3。

2.4凋亡相關(guān)Caspase-3活性

黃芩素作用SW480細(xì)胞后，Caspase-3活性隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，24 h后下降，各組趨勢(shì)一致。但與對(duì)照組比較，25μmol組Caspase-3活性變化不明顯；50和100μmol組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控的紊亂與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。抑制腫瘤細(xì)胞的過度增殖，選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是治療惡性腫瘤的一個(gè)方向[10]。治療上可以通過增加誘導(dǎo)凋亡基因的表達(dá)和抑制抗凋亡基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。本研究分析來自于黃芩的一種黃酮類化合物——黃芩素的抗腫瘤作用，將不同濃度的黃芩素作用于人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，通過MTT比色、形態(tài)學(xué)變化及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的增殖凋亡。

有研究表明，黃芩素能夠通過不同途徑抑制各種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。黃芩素能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[11]。黃芩素通過抑制胃癌細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞的增殖與凋亡[12]。黃芩素在20～120μmol濃度下能夠顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的生長(zhǎng)[13]。黃芩素呈劑量、時(shí)間依賴性抑制人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖，影響腫瘤細(xì)胞偽足的形成，導(dǎo)致細(xì)胞的侵襲力下降[14]。黃芩素通過抑制人乳腺癌細(xì)胞富含AT序列的特異結(jié)合蛋白1基因的表達(dá)，發(fā)揮其抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[15]；黃芩素經(jīng)Caveolin-1/AKT/mTOR途徑抑制人前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲[16]。

本研究表明，黃芩素能夠明顯抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖，并呈劑量、時(shí)間依賴性，而實(shí)驗(yàn)中筆者觀察到不同濃度黃芩素處理組72 h細(xì)胞抑制率相對(duì)48 h出現(xiàn)下降，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)對(duì)照組腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)72 h后細(xì)胞生長(zhǎng)速度下降，分析出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)以及對(duì)藥物敏感性下降有關(guān)，但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究證實(shí)。在顯微鏡下可以觀察到黃芩素處理組腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞核中染色質(zhì)凝集的形態(tài)學(xué)改變，提示在體外實(shí)驗(yàn)中黃芩素可能誘導(dǎo)結(jié)腸腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。為進(jìn)一步驗(yàn)證黃芩素促凋亡作用，本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞所占的比例，100μmol濃度黃芩素處理組的細(xì)胞凋亡比例顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），進(jìn)一步提示黃芩素能夠促進(jìn)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的凋亡。

Caspase蛋白家族和Bcl-2蛋白家族是參與凋亡進(jìn)程的兩個(gè)蛋白家族，前者負(fù)責(zé)凋亡的執(zhí)行，后者調(diào)控線粒體的完整性[17]。目前已確定哺乳動(dòng)物有14種Caspase酶類。其中Caspase-3屬于凋亡調(diào)控下游環(huán)節(jié)的剪切酶，可通過作用于多種底物，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控[16]。已有研究表明，Caspase-3表達(dá)率降低與喉癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[18]。

黃芩素可以促進(jìn)SW480細(xì)胞的Caspase-3活性增加，提示黃芩素可能通過Caspase-3依賴性信號(hào)通路來發(fā)揮促凋亡作用。

黃芩素作為來源于傳統(tǒng)中藥黃芩的天然化合物，在抗炎、抗腫瘤方面起一定的作用，臨床應(yīng)用潛力大，但黃芩素的抗腫瘤詳細(xì)機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步研究。

[1]FERLAY J,STELIAROVA-FOUCHER E,LORTET-TIEULENT J,et al.Cancer incidence and mortality patterns in Europe∶estimates for 40 countries in 2012[J].Eur J Cancer,2013,49(6)∶1374-1403.

[2]MUNRO AJ.Comparative cancer survival in European countries[J].Br Med Bull,2014,110(1)∶5-22.

[3]TARVER T.American cancer society cancer facts and figures 2014[J].Journal of Consumer Health on the Internet,2012,16(3)∶366-367.

[4]陳萬青,張思維,鄭榮壽,等.中國(guó)2009年惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國(guó)腫瘤,2013,1∶2-12.

[5]RAZINA TG,UDINTSEV SN,TIUTRIN II,et al.The role of thrombocyte aggregation function in the mechanism of the antimetastatic action of an extract of baikal skullcap[J].Vopr Onkol,1989,35(3)∶331-335.

[6]MAHMOOD N,PIZZA C,AQUINO R,et al.Inhibition of HIV infection by flavanoids[J].Antiviral Res,1993,22(2/3)∶189-199.

[7]KUBO M,KIMURA Y,ODANI T,et al.Studies on scutellariae radix.PartⅡ∶the antibacterial substance[J].Planta Med,1981,43(2)∶194-201.

[8]KYO R,NAKAHATA N,SAKAKIBARA I,et al.Baicalin and baicalein,constituents of an important medicinal plant,inhibit intracellular Ca2+elevation by reducing phospholipase C activity in C6 rat glioma cells[J].J Pharm Pharmacol,1998,50(10)∶1179-1182.

[9]MA Z,OTSUYAMA K,LIU S,et al.Baicalein,a component of scutellaria radix from huang-lian-jie-du-tang(HLJDT),leads to suppression of proliferation and induction of apoptosis in human myeloma cells[J].Blood,2005,105(8)∶3312-3318.

[10]GREENDR,GALLUZZIL,KROEMERG.Cellbiology.Metabolic control of cell death[J].Science,2014,345(6203)∶1446.

[11]向淼,徐細(xì)明,鄧君健,等.黃芩素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721凋亡作用的研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2012,6∶1098-1103.

[12]張偉,劉寬浩.黃芩素對(duì)胃癌細(xì)胞VEGF和HGF表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2011,11∶2135-2137.

[13]徐維恒,肖雷,馬宜明.黃芩素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231增殖的影響[J].中國(guó)藥師,2011,1∶26-28.

[14]任學(xué)群,李宜雄.黃芩素對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)能力的影響[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2010,3∶180-185.

[15]GAO XY,XUE XH,MA YN,et al.Effect of baicalein on the expression of SATB1 in human breast cancer cells[J].Experimental and Therapeutic Medicine,2015,9(5)∶1665-1669.

[16]GUO Z,HU X,XING Z,et al.Baicalein inhibits prostate cancer cell growth and metastasis via the caveolin-1/Akt/mTOR pathway[J].Mol Cell Biochem,2015,406(1/2)∶111-119.

[17]MCILWAIN D,BERGER T,MAK TW.Caspase functions in cell death anddisease[J].ColdSpring HarbPerspect Biol,2013,DOI∶10.1101/cshperspect.a026716.

[18]MAZUMDER S,PLESCA D,ALMASAN A.Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis[J].Methods Mol Biol,2008,414∶13-21.

（申海菊 編輯）

Effect of Baicalein on proliferation and apoptosis of SW480 cell line

Ning WANG,Ling-li CHANG,Qi CHENG,Yan-xin ZHANG
(Department of Basic Medical Science,Luohe Medical College,Luohe,Henan 462000,P.R.China)

【Objective】To study the effects of Baicalein on proliferation and apoptosis in human colon carcinoma cell line SW480,and to explore the apoptosis mechanism.【Methods】The effect of Baicalein on the proliferation of SW480 was detected by MTT analysis.The morphological manifestation of SW480 cells stained by Hoechst 33258 was investigated with fluorescence microscopy after the cells were treated with Baicalein for 48 hours.Apoptosis was also examined by flow cytometry.Variation regularity of the activity of caspase-3 was detected with the test kit.【Results】Baicalein significantly inhibited SW480 proliferation in a dose-and time-dependent manner.The characteristic morphological changes of apoptosis were observed under microscopy in SW480 cells treated with 150 μmol of Baicalein.It showed that the apoptosis rate in the group of 150 μmol Baicalein was significantly higher than that in the control group(P＜0.01).Baicalein promoted the activity of caspase-3 in SW480 cells in a dose-dependent manner.【Conclusions】Baicalein can inhibit the proliferation of SW480 cells and induce cell apoptosis through the caspase-3 dependent pathway.

Baicalein;colonic neoplasm;SW480;apoptosis;caspase-3

R735.35

A

1005-8982（2015）35-0022-05

2015-03-19