間變性大細(xì)胞淋巴瘤動(dòng)物模型的構(gòu)建與鑒定*

陳芳，劉曉麗，陳玉玲，李亞軍，牟東云，白雪芹，鄧飛

（1.遵義醫(yī)學(xué)院病理科，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院三病區(qū)，貴州遵義563000）

·論著·

間變性大細(xì)胞淋巴瘤動(dòng)物模型的構(gòu)建與鑒定*

陳芳1，劉曉麗1，陳玉玲1，李亞軍2，牟東云1，白雪芹1，鄧飛1

（1.遵義醫(yī)學(xué)院病理科，貴州遵義563003；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院三病區(qū)，貴州遵義563000）

目的探索間變性大細(xì)胞淋巴瘤（ALCL）小鼠模型的構(gòu)建方法。方法選取BALB/c小鼠為研究對(duì)象，環(huán)磷酰胺抑制小鼠機(jī)體免疫功能，用Karpas299細(xì)胞在小鼠體內(nèi)建立ALCL模型。結(jié)果①ALCL模型成功建立，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CD30和間變性淋巴瘤激酶（ALK）陽(yáng)性；②聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）結(jié)果顯示，核基因重組激活基因2（RAG2）條帶陽(yáng)性，大小517 bp；③環(huán)磷酰胺腹腔注射后，小鼠外周血CD3、CD8、CD19和CD20陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；④成瘤組小鼠外周血CD3、CD8、CD19及CD20陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著低于未成瘤組小鼠（P＜0.05）。結(jié)論采用環(huán)磷酰胺抑制小鼠機(jī)體免疫功能，可成功構(gòu)建BALB/c小鼠ALCL模型；細(xì)胞免疫功能低下可能是模型成功建立的原因或機(jī)制。

BALB/c小鼠；環(huán)磷酰胺；間變性大細(xì)胞淋巴瘤；Karpas299細(xì)胞株

間變性大細(xì)胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL）是一種T淋巴細(xì)胞來(lái)源的淋巴瘤。由于腫瘤細(xì)胞膜表面高表達(dá)CD30抗原，因而也被稱為Ki陽(yáng)性大細(xì)胞淋巴瘤。目前治療ALCL的方法仍以CHOP方案化療為主，但是該化療方案對(duì)ALCL復(fù)發(fā)及晚期患者的效果不明顯。近年來(lái)，以CD30抗原為靶向的治療藥物，如Brentuximabvedotin在晚期CD30陽(yáng)性[1-2]、間變性大細(xì)胞淋巴瘤[3]及霍奇金淋巴瘤的治療方面顯示出良好效果[4-5]，但是針對(duì)機(jī)體抗腫瘤方面的具體效應(yīng)及藥物安全性仍需進(jìn)行大量的臨床研究。由于ALCL發(fā)病率較低，約占非霍奇金淋巴瘤的2％～3％[6]，收集到足夠數(shù)量的患者作為研究對(duì)象是限制人們認(rèn)識(shí)及治療該疾病的一大障礙。而臨床研究大都基于回顧性分析，因此人們對(duì)其認(rèn)識(shí)和了解十分有限。建立ALCL模型，是開展ALCL發(fā)病機(jī)制、藥物療效等研究的基礎(chǔ)。ALCL與免疫系統(tǒng)的關(guān)系密切，其發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫微環(huán)境是密不可分的。無(wú)論是由于T淋巴細(xì)胞缺乏導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能缺陷的裸鼠，還是T、B淋巴細(xì)胞聯(lián)合缺乏導(dǎo)致細(xì)胞和體液免疫功能缺陷的SCID小鼠，又或是T、B淋巴細(xì)胞聯(lián)合缺陷同時(shí)伴有巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞活性降低的NOD/SCID小鼠，因其免疫功能缺陷，這些動(dòng)物模型并不能真實(shí)地模擬具有免疫功能的ALCL患者。為能更真實(shí)地模擬患者的臨床發(fā)病，更好地進(jìn)行針對(duì)ALCL的免疫靶向治療方面的研究，在有免疫力的小鼠身上建立ALCL動(dòng)物模型尤為重要。本研究經(jīng)環(huán)磷酰胺暫時(shí)抑制BALB/c小鼠免疫功能后，成功地建立ALCL荷瘤模型，并運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)小鼠成瘤過(guò)程中外周血T/B細(xì)胞表型的變化規(guī)律，初步揭示BALB/c小鼠的成瘤免疫學(xué)機(jī)制，為后期研究奠定良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和動(dòng)物

雌性BALB/c小鼠25只，4～6周齡，無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)，購(gòu)自北京阜康生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（京）2014-0004。人間變性大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Karpas 299購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心細(xì)胞庫(kù)。

1.2主要試劑及儀器

環(huán)磷酰胺購(gòu)自吉林修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，鼠抗人間變性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase，ALK）單克隆抗體、鼠抗人CD30單克隆抗體、鼠抗人CD20單克隆抗體、鼠抗人CD45RO單克隆抗體、山羊抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉生物有限公司，Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒、核基因重組激活基因2（recombination activating gene，RAG2）特異性引物購(gòu)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，抗鼠CD3、CD4、CD8、CD19、CD20熒光抗體及相應(yīng)同型對(duì)照購(gòu)自美國(guó)eBiosciense公司，流式細(xì)胞儀及其配套的計(jì)算機(jī)軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇Karpas299，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3次，無(wú)血清1640培養(yǎng)基洗滌3次，用含有20％胎牛血清、1％谷氨酰胺及雙抗的1640培養(yǎng)液將細(xì)胞混勻，37℃、5％二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液1次。

1.3.2 蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)將25只BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，A組為空白對(duì)照組，其余B、C、D及E組為實(shí)驗(yàn)組。用環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）250 mg/（kg·只）對(duì)BALB/c行一次腹腔注射，3 d后將制備好的ALCL細(xì)胞懸液（5×106個(gè)/0.5 ml）注入實(shí)驗(yàn)組小鼠的右上肢腋下，每隔3天在小鼠相同部位皮下注射，共種植3次。注射后0～2個(gè)月觀察動(dòng)物是否成瘤，待出現(xiàn)皮下腫塊后，取該小鼠皮下腫塊進(jìn)行HE染色觀察，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中CD30、ALK、CD45RO、CD20等抗原的表達(dá)。

1.3.3 RAG2基因表達(dá)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)雌性BALB/c小鼠外周血中是否表達(dá)RAG2基因。按試劑盒說(shuō)明書操作提取小鼠外周血DNA。BALB/c小鼠RAG2序列，正向引物：5'-GAGGAATCTCTGTCTCCAGTGC-3'，反向引物：5'-TCAACATCACAAGTAGGGCAAC-3'，產(chǎn)物大小517 bp。PCR反應(yīng)體系為20μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)。4℃保存PCR產(chǎn)物，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及凝膠成像系統(tǒng)并拍照。

1.3.4 檢測(cè)外周血T、B淋巴細(xì)胞亞群比例的變化流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)建模中BALB/c小鼠外周血T、B淋巴細(xì)胞亞群比例變化。取環(huán)磷酰胺處理及皮下接種Karpas299細(xì)胞后的BALB/c小鼠，觀察期為0～2個(gè)月。建模第24天將接種腫瘤細(xì)胞后的小鼠分為兩組，即成瘤組和未成瘤組。在環(huán)磷酰胺注射后的第3、10、17和24天，摘眼取血法收集小鼠外周血于抗凝管中，加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，冰上靜置10 min，4℃、1 500 r/min離心5 min，棄上清液；加入2 ml 0.1％的BSA-PBS洗滌，離心方法同前，重復(fù)3次；加入200μl PBS重懸，分裝到流式管1號(hào)和2號(hào)各100μl；在1號(hào)管中加入1.0μl抗鼠CD3-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、0.7μl抗鼠CD19-別藻藍(lán)蛋白（Allophycocyanin，APC），在2號(hào)管中加入0.5μl抗鼠CD4-FITC、0.7μl抗鼠CD8-APC、1.3μl抗鼠CD20-藻紅蛋白（Phycoerythrin，PE），各單克隆抗體相應(yīng)同型對(duì)照按相同組合和相同劑量加入另外的流式管3號(hào)和4號(hào)中（抗體劑量參照美國(guó)eBiosciense公司相應(yīng)流式抗體說(shuō)明書）。渦旋振蕩器震蕩3次，避光孵育20 min，加入2 ml 0.1％BSA-PBS離心，棄上清液，加入1％多聚甲醛200μl固定。上機(jī)檢測(cè)或4℃避光保存，檢測(cè)外周血CD3、CD4、CD8、CD19及CD20的變化。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用正態(tài)分布、方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析（One-way，ANOVA），方差齊用LSD法，方差不齊用DunnettT3法，生存分析用Kaplan-Meier法，生存曲線的比較用Log-rank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1小鼠一般及存活狀況

環(huán)磷酰胺處理后觀察各實(shí)驗(yàn)組無(wú)死亡現(xiàn)象，Karpas299細(xì)胞懸液移植到小鼠左或右上肢皮下，實(shí)驗(yàn)組（B、C、D及E組）小鼠于次日即出現(xiàn)明顯的急性移植物抗宿主?。╝cute graft versus host disease，aGVHD）反應(yīng)，表現(xiàn)為毛發(fā)豎立、不順無(wú)光澤，活動(dòng)量減小，進(jìn)食量下降，體重減輕等，并出現(xiàn)小鼠聚堆現(xiàn)象，個(gè)別小鼠還出現(xiàn)弓背體位。移植后第1周反應(yīng)較重，第2周開始aGVHD反應(yīng)減輕。移植后第5天開始，各移植實(shí)驗(yàn)組小鼠皮下陸續(xù)出現(xiàn)腫塊。最后一次移植細(xì)胞至處死小鼠，共觀察60 d。移植組小鼠總體成瘤率為80％（16/20），腫瘤生長(zhǎng)處皮膚出現(xiàn)脫毛及潰爛表現(xiàn)。僅C組有1只成瘤小鼠自然死亡，其余小鼠全部存活，為人為脫頸處死。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠成瘤率比較

2.2小鼠腫瘤的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

2.2.1 腫瘤的形態(tài)學(xué)觀察空白對(duì)照組小鼠（A組）未見(jiàn)異常變化。80％的實(shí)驗(yàn)組小鼠（B、C、D及E組）于左或右上肢皮下可見(jiàn)明顯腫塊，觸之無(wú)波動(dòng)感，因腫塊位于小鼠上肢，影響小鼠活動(dòng)，致各實(shí)驗(yàn)組小鼠活動(dòng)量減小。解剖腫瘤組織發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織固定分布于小鼠左或右上肢接種部位，與周圍組織分界不清楚，圓形或橢圓形，腫塊最大達(dá)20 mm×20 mm×10 mm，切面呈魚肉狀外觀。解剖其他臟器，未見(jiàn)腹水形成及腹腔臟器粘連，未見(jiàn)其余臟器和遠(yuǎn)處淋巴結(jié)浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。小鼠種植腫瘤組織見(jiàn)圖1。

2.2.2 腫瘤的組織學(xué)鑒定取腫瘤組織行HE染色觀察，腫瘤細(xì)胞形態(tài)多樣、體積較大（約為2～3個(gè)組織細(xì)胞體積大?。蕡A形、橢圓形或多邊形。細(xì)胞核多樣性，呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，見(jiàn)胚胎樣核，核型彎曲，核膜一側(cè)平滑微凸，另一側(cè)凹陷見(jiàn)多個(gè)切跡。部分瘤細(xì)胞與霍奇金病瘤巨細(xì)胞（Reed-sternberg，R-S）的雙核瘤細(xì)胞相似，但未見(jiàn)診斷性R-S細(xì)胞。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)顯示，腫瘤組織CD30陽(yáng)性，ALK陽(yáng)性，CD45RO陽(yáng)性，CD20陰性。經(jīng)鑒定為ALK陽(yáng)性的間變性大細(xì)胞淋巴瘤。見(jiàn)圖2、3。

圖1 小鼠腫瘤解剖圖

圖2 小鼠腫瘤病理組織HE染色

圖3 小鼠腫瘤組織免疫組織化學(xué)法檢測(cè)（×400）

2.3小鼠外周血中RAG2基因的表達(dá)

PCR檢測(cè)雌性BALB/c小鼠外周血中RAG2基因表達(dá)結(jié)果顯示，擴(kuò)增出RAG2基因517 bp特異性DNA條帶，而對(duì)照組NOD/SCID小鼠則未見(jiàn)該條帶。見(jiàn)圖4。

2.4不同時(shí)間BALB/c小鼠外周血T、B淋巴細(xì)胞亞群比例

按照上述建模方法重新訂購(gòu)36只小鼠，分別檢測(cè)注射CTX前（空白組）及注射CTX后第3、10、17和24天小鼠T/B細(xì)胞免疫表型的變化，環(huán)磷酰注射后第3天，CD19陽(yáng)性細(xì)胞比例首先下降，低于空白組（P＜0.05）；第10天，所有免疫參數(shù)值低于空白組，其中CD3、CD4、CD8、CD19及CD20陽(yáng)性細(xì)胞比例下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第17天CD3、CD4、CD8及CD19陽(yáng)性細(xì)胞較第10天開始回升，但CD8、CD19和CD20陽(yáng)性細(xì)胞比例仍低于空白組（P＜0.05）。至建模后第24天檢測(cè)未成瘤組與成瘤組小鼠外周血T、B淋巴細(xì)胞，未成瘤組CD3、CD4、CD8及CD20陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯高于成瘤組（P＜0.05）。見(jiàn)表2、3。

圖4 小鼠外周血中RAG2的PCR檢測(cè)

表2 各組小鼠外周血的免疫水平變化（n=6±s）

表2 各組小鼠外周血的免疫水平變化（n=6±s）

組別CD3/％CD4/％CD8/％CD19/％CD20/％CD4/CD8空白組32.59±12.3612.72±6.6010.84±2.6826.17±5.305.92±2.401.12±0.34 CTX后第3天66.47±14.7531.46±15.899.74±0.792.16±1.279.85±2.283.16±1.36 CTX后第10天14.19±1.633.74±0.281.26±0.785.51±0.702.92±0.032.98±0.04 CTX后第17天20.94±0.3717.76±0.596.14±0.289.03±0.132.66±0.852.89±0.04 CTX后第24天25.94±1.0716.36±3.733.97±0.899.21±0.211.83±0.214.12±0.02F值10.3742.98316.23429.2028.6805.492P值0.0050.0990.0010.0000.0080.025

表3 成瘤組與未成瘤組小鼠外周血T、B淋巴細(xì)胞亞群比例（n=6，±s）

表3 成瘤組與未成瘤組小鼠外周血T、B淋巴細(xì)胞亞群比例（n=6，±s）

組別CD3/％CD4/％CD8/％CD19/％CD20/％CD4/CD8成瘤組3.83±2.122.03±0.920.41±0.231.24±1.215.27±1.715.8±4.34未成瘤組P值37.10±21.31 0.010 29.42±19.45 0.007 1.95±0.48 0.000 0.49±0.18 0.000 33.12±15.07 0.001 14.29+6.45 0.094

3 討論

1985年德國(guó)病理學(xué)家STEIN等在制備CD30單抗過(guò)程中首次描述間變性大細(xì)胞淋巴瘤，屬于惡性侵襲性T細(xì)胞淋巴瘤的一個(gè)亞型。2008年，WHO在淋巴瘤的最新分類中，根據(jù)原發(fā)系統(tǒng)性ALCL是否表達(dá)ALK激酶，分為ALCL陰性、ALK陽(yáng)性及ALCL陰性、ALK陰性[7-9]。因其發(fā)病率極低，收集到足夠數(shù)量的ALCL臨床病例來(lái)進(jìn)行ALCL藥物靶向治療方面的研究較困難，故成功建立ALCL動(dòng)物模型是深入研究該疾病及其治療策略的重要途徑。ALCL屬淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，與人體免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，因此在具有免疫功能的小鼠身上建立腫瘤模型才能更真實(shí)地模擬腫瘤自然發(fā)生的過(guò)程。而目前建立的小鼠腫瘤動(dòng)物模型中，選用的小鼠多為免疫缺陷鼠，如裸鼠、SCID及NOD/SCID小鼠[10-11]。而NOD/SCID小鼠，是SCID小鼠與非肥胖糖尿病小鼠（NOD/Lt）雜交而成，其不僅有SCID小鼠的V（D）J重排缺陷，還缺乏功能性自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）及循環(huán)補(bǔ)體。正常小鼠體內(nèi)RAG2基因參與淋巴細(xì)胞發(fā)育和V（D）J基因的重排[12-14]。而免疫缺陷的SCID小鼠及NOD/SCID小鼠，因抗原V（D）J基因重排受阻，體內(nèi)無(wú)法檢測(cè)到RAG2基因。本實(shí)驗(yàn)將RAG2基因作為鑒定BALB/c小鼠與免疫缺陷小鼠的一個(gè)鑒別點(diǎn)。

淋巴造血系統(tǒng)來(lái)源的腫瘤與復(fù)雜的免疫環(huán)境密切相關(guān)，而且患者并非都有免疫缺陷。因此無(wú)論是在T細(xì)胞缺陷還是T、B細(xì)胞聯(lián)合缺陷的小鼠身上建立腫瘤模型，與真正腫瘤患者所處的免疫微環(huán)境并不一致，該模型并不能模擬具有免疫功能的ALCL患者。國(guó)內(nèi)學(xué)者劉芳等[11]也在具有正常免疫力的BALB/c小鼠身上成功構(gòu)建鼠源性的淋巴瘤動(dòng)物模型，但在BALB/c小鼠身上建立人源性的ALCL模型國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。

由于BALB/c小鼠直接接種人源性Karpas299細(xì)胞后有嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)，所以應(yīng)首先對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行暫時(shí)的免疫抑制后才能進(jìn)行小鼠的成瘤實(shí)驗(yàn)。目前，暫時(shí)抑制小鼠免疫反應(yīng)的方法主要有：①移植前采取亞致死劑量照射；②移植前應(yīng)用NK細(xì)胞抗體降低NK細(xì)胞活性；③使用具有免疫抑制作用的化療藥物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行預(yù)處理。因環(huán)磷酰胺是一種具有強(qiáng)烈骨髓抑制作用的經(jīng)典烷化劑類免疫抑制劑，單次高劑量一次性腹腔注射可造成機(jī)體的免疫功能暫時(shí)性下降，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4+T細(xì)胞比例下調(diào)50％左右。免疫抑制2周后，機(jī)體的免疫功能可逐漸恢復(fù)[15]。該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)T/B細(xì)胞各亞型指標(biāo)基本相符。有研究表明，大劑量環(huán)磷酰胺注射后可誘導(dǎo)動(dòng)物對(duì)機(jī)體免疫耐受，對(duì)多種特異性抗原在一段時(shí)間內(nèi)無(wú)應(yīng)答反應(yīng)。但是關(guān)于環(huán)磷酰胺建立動(dòng)物免疫抑制模型的方法，目前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有統(tǒng)一的給藥劑量標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)摸索，探索出環(huán)磷酰胺最佳建模劑量為250 mg/kg一次性腹腔注射。

本實(shí)驗(yàn)選取成熟T細(xì)胞的特異性標(biāo)志細(xì)胞表型CD3及其分化后的CD4+（Th）、CD8+（CTL）和B細(xì)胞表型CD19、CD20作為檢測(cè)指標(biāo)。在抗瘤效應(yīng)方面，CD4+T細(xì)胞的功能不僅限于輔助細(xì)胞毒T細(xì)胞，而且可以協(xié)助NK細(xì)胞清除和殺滅腫瘤，甚至還具有不依賴于CD8+CTL的腫瘤殺傷作用。CD8+CTL在腫瘤免疫中起關(guān)鍵性作用，主要通過(guò)FasL/Fas、顆粒酶的途徑直接殺傷腫瘤細(xì)胞。CD19表達(dá)于全部B細(xì)胞上，是鑒定B細(xì)胞的重要標(biāo)志之一。CD20發(fā)揮調(diào)節(jié)B細(xì)胞增殖、分化的功能，在B細(xì)胞激活后逐漸丟失。B細(xì)胞產(chǎn)生抗瘤抗體并通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）發(fā)揮抗瘤效應(yīng)，還可對(duì)各種免疫細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)或作為抗原提呈細(xì)胞參與腫瘤免疫。通過(guò)檢測(cè)經(jīng)環(huán)磷酰胺處理后的外周血T、B淋巴細(xì)胞亞群發(fā)現(xiàn)，注射環(huán)磷酰胺第3天，CD19+B細(xì)胞開始下降，這符合B淋巴細(xì)胞較T細(xì)胞對(duì)環(huán)磷酰胺更為敏感的報(bào)道。而腫瘤細(xì)胞接種后的第1周，CD3+、CD8+細(xì)胞比例下降尤為明顯，此時(shí)機(jī)體經(jīng)歷嚴(yán)重的免疫抑制過(guò)程；第10天，CD3+、CD4+、CD8+、CD19+及CD20+下降到最低水平。環(huán)磷酰胺所致小鼠體內(nèi)免疫功能下降，為Karpas299細(xì)胞的免疫逃逸及在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)創(chuàng)造條件，因此本實(shí)驗(yàn)在注射環(huán)磷酰胺后的第3天開始注射Karpas299細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者曾采用一次性注射腫瘤細(xì)胞的方法建立腫瘤模型，但小鼠成瘤率極低，個(gè)別成瘤小鼠有自發(fā)性消退現(xiàn)象?？紤]為移植細(xì)胞數(shù)量太少，小鼠體內(nèi)尚存的免疫功能使腫瘤細(xì)胞無(wú)法在體內(nèi)存活，所以在后期實(shí)驗(yàn)中筆者采用間隔注射法，即每4天1次，共注射3次，使小鼠的成瘤率達(dá)80％。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠第17和24天外周血，與第10天CD3+、CD4+、CD8+、CD19+及CD20+比較，各檢測(cè)指標(biāo)雖然已開始恢復(fù)，但仍較空白組低。且小鼠體內(nèi)腫瘤依舊能迅速生長(zhǎng)，分析其原因可能是小鼠體內(nèi)已發(fā)生腫瘤免疫耐受，形成適合腫瘤生長(zhǎng)的免疫微環(huán)境。

注射腫瘤細(xì)胞24 d后，按小鼠注射部位是否有可見(jiàn)腫塊將小鼠分為未成瘤組與成瘤組，檢測(cè)小鼠外周血中T、B淋巴細(xì)胞表型。未成瘤組CD3+、CD4+、CD8+及CD20+細(xì)胞比例較成瘤組高（P＜0.01），考慮可能是小鼠對(duì)環(huán)磷酰胺的耐受存在個(gè)體差異。即使對(duì)環(huán)磷酰胺耐受較強(qiáng)的小鼠按照250 mg/kg體重給藥，機(jī)體仍存在較高的免疫力，使Karpas299細(xì)胞在體內(nèi)無(wú)法正常存活。同時(shí)機(jī)體龐大的免疫網(wǎng)絡(luò)和腫瘤的相互作用使腫瘤免疫異常復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)正常生長(zhǎng)需經(jīng)歷一系列適應(yīng)過(guò)程。但未成瘤組小鼠的T、B細(xì)胞各亞群比例較成瘤組高，說(shuō)明在機(jī)體的抗腫瘤免疫過(guò)程中，細(xì)胞免疫和體液免疫均為重要的免疫殺傷因素。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)間變性大細(xì)胞淋巴瘤成瘤過(guò)程中特異性免疫細(xì)胞T、B細(xì)胞在建瘤過(guò)程中的免疫表型變化，而對(duì)T、B細(xì)胞在抗腫瘤中的具體作用及其分泌的細(xì)胞因子對(duì)腫瘤影響的研究，尚需實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)使用環(huán)磷酰胺免疫抑制處理BALB/c小鼠后，可成功建立ALCL模型，為后續(xù)ALCL的免疫靶向治療提供較好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（申海菊 編輯）

Establishment of anaplastic large cell lymphoma model in mice*

Fang CHEN1,Xiao-li LIU1,Yu-ling CHEN1,Ya-jun LI2,Dong-yun MOU1,Xue-qin BAI1,Fei DENG1
(1.Department of Pathology,Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563003,P.R.China;2.The Third Ward,the Affiliated Tumor Hospital,Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563000,P.R.China)

【Objective】To evaluate the establishment method of anaplastic large cell lymphoma(ALCL)model in mice.【Methods】BALB/c mice were chosen as research subjects.Cyclophosphamide(CTX)was used to inhibit the immune function of mice,and then the ALCL model was established by Karpas 299 subcutaneous injection.【Results】①ALCL model was successfully established.The immunohistochemistry result showed both CD30 and anaplastic lymphoma kinase(ALK)were positive.②The PCR result showed that the RAG2gene was positive and had 517 bp.③The percentages of CD3+,CD8+,CD19+and CD20+cells after CTX injection were lower than those before injection((P＜0.05).④The percentages of CD3+,CD8+,CD19+and CD20+cells in the tumor group were significantly lower than those in the non-tumor group(P＜0.05).【Conclusions】Using cyclophosphamide to inhibit the immune function,ALCL model of BALB/c mice can be successfully established.The low cellular immune function may be the reason or mechanism of successful establishment of ALCL model.

BALB/c mouse;cyclophosphamide;anaplastic large cell lymphoma;Karpas 299 cell line

1005-8982（2015）35-0001-06

R733

A

2015-03-25

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81160300）

鄧飛，E-mail：hishnuj778@126.com